Vrstični elektronski mikroskop

Vrstični ali 'scanning' elektronski mikroskop (SEM) poleg visoke ločljivosti odlikuje predvsem velika globinska ostrina, zato je namenjen tridimenzionalnemu opazovanju površin in analizi struktur pri velikih povečavah.

[ Več... ]

 

Kremenasta alga Ceratocoris armata
Kremenasta alga Ceratocoris armata

Vrstični EM
(fotografija: Kazimir Drašlar)

Ličinka navadne metuljčice Libelloides (Ascalaphus) macaronius
Ličinka navadne metuljčice Libelloides (Ascalaphus) macaronius

Vrstični EM
(fotografija: Kazimir Drašlar)

Bakterija Helicobacter sp.
Bakterija Helicobacter sp.

Vrstični EM
(fotografija: Kazimir Drašlar)


Vrstični elektronski mikroskop Jeol JSM-7500F

Zgodovina SEM na Oddelku za biologijo

Začetki elektronske mikroskopije segajo v leto 1931, ko je Ernst Ruska s sodelavci razvil prvi elektronski mikroskop, za kar je leta 1986 prejel Nobelovo nagrado za fiziko. Prvi vrstični elektronski mikroskop so izdelali približno deset let kasneje.

Začetek elektronske mikroskopije na Oddelku za biologijo sega že v leto 1975, kar je le desetletje po tem, ko se je na tržišču pojavil prvi komercialni SEM. Prvi vrstični elektronski mikroskop na Oddelku Stereoscan 600 (Cambridge Instruments, Velika Britanija) je bil tako drugi SEM v Sloveniji in prvi delujoči mikroskop na področju biomedicinskih ved v takratni Jugoslaviji. Mikroskop je deloval do leta 1987, ko je na Oddelku pričel obratovati vrstični elektronski mikroskop JSM-840A (JEOL, Japonska) nadgrajen z sistemom za pripravo in opazovanje zamrznjenih vzorcev.

Z letom 2010 je na Oddelku pričel delovati vrstični elektronski mikroskop JSM-7500F (JEOL, Japonska) s hladnim virom elektronov na poljsko emisijo (FE-SEM). Mikroskop je kot edini na področju biomedicine v Sloveniji prilagojen opazovanju občutljivih vzorcev z zelo visoko ločljivostjo pri majhnih energijah primarnega snopa elektronov. Z dvema detektorjema sekundarnih elektronov in detektorjem povratno sipanih elektronov je JSM 7500F primeren za opazovanje površin bioloških vzorcev in živil, kot tudi občutljivih anorganskih materialov (polimerov, filmov, olj, pen), ki jih visoke pospeševalne napetosti primarnega snopa elektronov v vrstičnih elektronskih mikroskopov namenjenih opazovanju in analizi odpornejših anorganskih materialov lahko poškodujejo. Nakup mikroskopa je bil izveden kot skupna investicija Oddelka za biologijo in sovlagateljev ter podprt s sredstvi Javne agencije za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije. Poleg solastnikov je dostop do mikroskopa omogočen tudi drugim uporabnikom.


Delovanje

Pri elektronski mikroskopiji kot vir valovanja uporabljamo elektrone, ki zaradi kratke valovne dolžine teoretično omogočajo do 100.000-krat boljšo ločljivost od vidne svetlobe. Zaradi njihove majhne mase je pot elektronov v zraku omejena, zato je potrebno v notranjosti elektronskega mikroskopa zagotavljati vakuum. Vir elektronov (elektronska puška) je nameščen v zgornjem delu mikroskopa (slika). Elektro-magnetne leče v kondenzorju izsevane elektrone zberejo v ozek snop, ki ga nato deflektor v vrsticah vodi po površini preparata. Ob stiku snopa elektronov s površino preparata prihaja do vrste reakcij, med drugim tudi do izbijanja sekundarnih elektronov iz površine preparata, ki jih zazna detektor. Ojačan signal sekundarnih elektronov potuje v katodno cev, kjer ga z deflektorjem v mikroskopu usklajen sistem vodi na površino ekrana. Slika na ekranu tako nastaja sočasno s pomikanjem snopa elektronov po površini preparata, povečava mikroskopa pa je razmerje med površino ekrana in površino skeniranega preparata.

Vrstični elektronski mikroskop (SEM) je namenjen opazovanju površine preparata zato, za razliko od transmisijske elektronske mikroskopije (TEM), debelina preparata pri SEM ni pomembna. V primerjavi s TEM so pospeševalne napetosti na katodi elektronske puške SEM manjše in se gibljejo med 2 in 40 keV, kar omogoča ločljivost v rangu enega nanometra. Uporabne povečave SEM se gibljejo med 5 in 500.000-krat. Ker pa je ločljivost v veliki meri odvisna od obstojnosti vzorca med opazovanjem - ta je pri bioloških vzorcih majhna, je praktična ločljivost SEM pri opazovanju bioloških vzorcev nekaj deset nanometrov. Poleg opazovanja površin z detekcijo sekundarnih elektronov pa SEM ob uporabi ustreznih detektorjev omogoča tudi analizo preparatov na podlagi katodoluminiscence in sekundarnih elastično sipanih elektronov, ter kemijsko analizo na podlagi izsevanih rentgenskih žarkov.


Priprava preparatov

Priprava bioloških preparatov za SEM je zahteven in razmeroma dolgotrajen postopek, saj je potrebno biološke vzorce obdelati tako, da kljubujejo pogojem med opazovanjem v mikroskopu: visokemu vakuumu in snopu elektronov, pri tem pa ohranijo svojo obliko.

Po primerni kemični ali fizikalni (zmrzovanje) fiksaciji, s katero ohranimo strukture vzorcev, je potrebno iz preparatov odstraniti vodo, ki bi v visokem vakuumu mikroskopa sicer zavrela, ter tako poškodovala preparat in onesnažila notranjost mikroskopa. Vodo odstranjujemo s sušenjem pri kritični točki (CPD), liofilizacijo ali z evaporacijo ustreznih kemičnimi sredstev, s katerimi predhodno nadomestimo vodo v vzorcih. Posušene vzorce pritrdimo na valjaste kovinske nosilce in jih z aparaturo za napraševanje kovin prekrijemo s tanko plastjo ogljika, platine ali zlata, ki dodatno zaščiti vzorec ter poveča količino iz vzorca izbitih elektronov in s tem kvaliteto nastale slike.

Naprava za sušenje vzorcev pri kritični točki (CPD)

Naprava za napraševanje kovin

Biološki vzorci pripravljeni za opazovanje s SEM