Apotome
konfokalni mikroskop s strukturirano osvetlitvijo
ApoTome® je dodatek za svetlobni mikroskop, ki omogoča zajemanje optičnih rezin z navadno epifluorescenčno osvetlitvijo. Bistvo Apotoma je steklena ploščica z mrežico vzporednih črt, ki se projicira na preparat, programska oprema pa nato iz zajetih slik izračuna optično rezino. Tako navaden svetlobni mikroskop dobi konfokalne lastnosti. Opazujemo lahko do približno 200 mikrometrov debele preparate, pod pogojem, da vsebujejo snovi, ki fluorescirajo.
- Axioimager Z1 + Apotome: kontakt Rok Kostanjšek, Aleš Kladnik
Fluorescentno obarvan nevron v gangliju stenice
Apotome, projekcija skladovnice optičnih rezin
Sekundarne celične stene v lesu lipe
Apotome, 3D rekonstrukcija
Bakterije v črevesju izopodnega raka Porcellio scaber
Apotome, diferencialni interferenčni kontrast (levo), desno fluorescenca oligonukleotidne sonde, optična rezina z Apotomom
Delovanje
ApoTome® je registrirano ime podjetja Carl Zeiss
Pri epifluorescenčni mikroskopiji je velik problem emitirana (izsevana) svetloba, ki sveti v fokusno ravnino preparata iz ravnin, ki so izven fokusa. Zato je slika debelejših preparatov motna. Ena od rešitev za to težavo je laserski konfokalni mikroskop, s katerim ekscitiramo (vzbujamo) in opazujemo preparat le točkasto. Slabost takega tipa mikroskopa je, da smo omejeni z valovno dolžino laserja, ki ga imamo na voljo. Že pred časom so Neil, Juškaitis in Wilson v Optics Letters leta 1997 objavili enega prvih člankov o uporabi "strukturirane osvetlitve" s pomočjo katere iz slike preparata odstranimo svetlobo, ki je izven fokusa preparata. Na ta način lahko izdelujemo optične rezine z navadnim fluorescenčnim mikroskopom, ki tako dobi konfokalne lastnosti. Prednost navadne fluorescenčne mikroskopije je uporaba množice različnih filtrov za ekscitacijo in emisijo z enim samim virom svetlobe (živosrebrna ali ksenonska žarnica), tako da lahko za označevanje preparatov uporabljamo cel spekter različnih fluorokromov.
Svetlobni mikroskop AxioImager Z1 z dodatkom ApoTome
Zaradi teh prednosti smo na Oddelku za biologijo v sodelovanju z Oddelkom za lesarstvo v letu 2005 kupili mikroskop AxioImager Z1 (Carl Zeiss) z dodatkom ApoTome, ki omogoča izdelavo optičnih rezin. Mikroskop je postavljen v mikroskopirnici Katedre za zoologijo in od postavitve naprej ga s pridom uporabljajo tako raziskovalci na Oddelku za biologijo, kot tudi zunanji raziskovalci.
Izdelava optičnih rezin
V drsniku Apotoma je steklena ploščica z mrežico vzporednih črt, ki se vstavi v optično pot epifluorescenčne osvetlitve, v ravnino poljske zaslonke, tako, da se vzorec mrežice projicira v ravnino fokusa preparata. Mrežica v optični poti niha gor in dol, kamera na mikroskopu pa zajame tri slike, na katerih je mrežica v različnih položajih na sliki. Programska oprema nato iz razlik med temi slikami izlušči samo tiste dele slike preparata, ki so ostri (v fokusu).
Skica preparata slikanega z navadnim fluorescenčnim mikroskopom, nato tri slike, na katerih je vidna slika mrežice v različnih položajih, na zadnji sliki pa skica optične rezine (slika preparata z odstranjeno svetlobo iz ravnin izven fokusa) (slika: © Carl Zeiss)