TOKSINOLOGIJA Z OSNOVAMI TOKSIKOLOGIJE

Prof. Dr. Tom Turk

 

 

 Toksikologija je veda, ki preučuje škodljive vplive kemičnih snovi na žive organizme. Toksikologijo lahko razdelimo na več poddisciplin, kot so:

- ekotoksikologija

- agrarna toksikologija

- izvedenska toksikologija

- toksikologija dela in športa

- analitska toksikologija

Toksinologija je veda, ki se ukvarja s preučevanjem mikrobnih, rastlinskih in živalskih strupov (toksinov). Gledano širše je del toksikologije, čeprav se razvija v samostojno znanstveno disciplino.

Obe vedi sta multidisciplinarni in vključujeta

-kemične

-biokemične

-genetske

-patofiziološke

-fiziološke

-farmakološke

-imunološke in druge raziskave

Zastrupitev kot končni odraz delovanja strupenih, bodisi umetnih ali naravnih snovi vključuje:

-sam strup

-zastrupljeni organizem

-poškodbo celic oziroma porušitev homeostaze

-simptome zastrupitve in smrti

Ti elementi so vzrok, subjekt, učinke in posledice zastrupitve. Za zastrupitev mora biti v organizmu nakopičena zadostna količina strupa, da pride v občutljivih organih, tkivih in celicah do poškodb, ki vplivajo na normalno delovanje organizma. Pojavijo se simptomi zastrupitve, ki lahko v resnih primerih povzročijo smrt zastrupljenega organizma.

Čeprav je v toksikologiji zastrupitev lahko tudi kronična, pa se najpogosteje odraža v akutni obliki (delovanje pravih toksinov je praviloma vedno zelo hitro).

Definicija strupa:

Strup je snov, ki lahko v določenih razmerah povzroči različne simptome v prizadetem organizmu.

"Snov" je skoraj vedno sinonim za neko kemikalijo, kot so npr. alkaloidi, pesticidi, herbicidi, polutanti ali živalski proteini. Toksično je tudi radioaktivno sevanje, ki izvira iz nekega radioaktivnega izotopa. Izraz "določene razmere" je najpogosteje povezan s količino vnešenega strupa ali t.i. "dozo". Pojem "doze" je zelo pomemben, saj je v veliki količini lahko pogubna tudi popolnoma neškodljiva snov ali celo zdravilo. Snov, ki deluje kot zdravilo, je lahko v preveliki dozi tudi strup.

Klasifikacija strupov

Strupi so tako raznolike snovi, da jih ne moremo preprosto razdeliti po le enem kriteriju, za to jih delimo glede na:

-izvor

-agregatno stanje

-kemično zgradbo

-fiziološko in farmakološko aktivnost

-območje delovanja oz. glede na del organizma, na katerega deluje

-uporabo

 

Nekaj o zgodovini strupov

            Nedvomno so bili že prvi ljudje soočeni z nekaterimi strupenimi rastlinami in živalmi. Zelo verjetno je, da so nekatere od njih tudi poznali in se jim izogibali. Kasneje so določene strupe uporabljali tudi za lov, kot to še dandanes počno številna indijanska plemena ob Amazonki. Ljudje so se bolj podrobno začeli ukvarjati s strupi okrog 1500 let pr. n. š. Iz tistega časa (Egipčani) so znani prvi medicinski zapiski (Eberski papirusi). Stari Egipčani so znali izolirati cianid iz jedrc marelic. Arzen, opij in akonitin pa so poznali že Vede ki so živeli v Indiji (okrog 900 let pr. n. š.). Stari Kitajci so uporabljali akonitin kot strup za premaz puščic. Hipokrat je v svojih zapiskih (400 let pr. n. š.) nedvoumno povedal, da so bili stari Grki pravi poznavalci strupov in njihovih osnovnih toksikoloških značilnosti. Ker so bile zastrupitve v antični Grčiji dokaj pogoste, se je razvila prava znanost o vseh mogočih protistrupih, ki seveda večinoma niso bili učinkoviti. Nikander iz Kolofona, ki je bil osebni zdravnik bitnijskega kralja Atale, je delal poskuse z raznimi strupi na obsojencih. Izsledke svojih raziskav je objavil v delu (Theriaca et Alexipharmica), kjer obravnava 22 strupov, med njimi tudi svinčev oksid, kantaridin, opij ter alkaloide, kot so akonitin iz preobjede, koniin iz pikastega mišjaka in hiosciamin iz črnega zobnika. Grški zdravnik Dioskorid ki je živel v letih 50 n.š. je razdelil strupe na strupe živalskega, rastlinskega in mineralnega izvora. Njegovo delo Materia Medica je bilo v veljavi vse do 15. stoletja. Zanimanje za toksikologijo je v tistem času nedvomno izhajalo iz uporabe strupov za umore, samomore in politične atentate. Dobro je znano, da so Sokrata umorili z napitkom, ki je vseboval coniin iz pikastega mišjaka. To je bil v Atenah takrat uradni strup (tudi danes v nekaterih ameriških državah na smrt obsojene usmrtijo s strupeno injekcjo). Rimski cesar Neron je zaposlil celo profesionalnega zastrupljevalca, ki je moril cesarju neljube osebe. Plinij (23-79 n.š.) je napisal zajetno delo Historia Naturalis, v katerem popisuje tudi strupene živali. Strupe so skušali uporabljati tudi za odpravo raznih bolezni. Tako je Maimonides (1135-1204) napisal delo Strupi in njihovi antidoti, v katerem podrobno opisuje zdravljenje z nekaterimi strupi, ki naj bi bili učinkoviti za določeno bolezen. V srednjem veku so uporabo strupov za politične umore, zlasti v Italiji, povzdignili v pravi kult. Najbolj znani po svojih zastrupljevalskih metodah, s katerimi so se znebili političnih nasprotnikov, so bili Borgijci. Katarina Medičejska pa je v Franciji svoje strupene zvarke preiskušala na revnih in bolnih ljudeh. Eden najbolj zaslužnih za razvoj toksikologije je bil Paracelsus (1493- 1541), ki je v toksikologijo uvedel poskus in jo tako znanstveno utemeljil. Razlikoval je med zdravilnimi in toksičnimi učinki strupenih snovi in uvedel pojmovanje doza-odgovor. Izvedensko toksikologijo je utemeljil španski zdravnik Orfila v 19. st. V 19. st. se je toksikologija začela hitro razvijati, Claude Bernard (1813-1878) pa je menil, da se da s pomočjo strupov preučevati različne biološke sisteme. Tako je predpostavil da kurare deluje na žične končiče ali na motorično ploščico. V 20. st. doseže toksikologija pravi razcvet, sprva žal z uporabo bojnih plinov (prvič v 1. svetovni vojni) in iskanjem ustreznih zaščitnih sredstev. Z razvojem kemične industrije pa je toksikologija postala del našega vsakdana, kar je na žalost večkrat slabo kot pa dobro. Za vse kemikalije, ki jih proizvaja človek lahko z gotovostjo trdimo, da neškodljivih kemikalij ni, so pa načini, kako jih lahko varno uporabljamo.

 

Strup in organizem

Vnos strupenih snovi v organizem

            Strupene snovi se vnesejo v organizem na različne načine. Da bi nek strup deloval, se mora nakopičiti v telesu, do take mere, da to povzroči znake zastrupitve. Toksikologija loči štiri osnovne načine vnosa strupov v organizem, do katerega pride ob stiku z določeno strupeno snovjo. Živalski in rastlinski strupi in strupi mikroorganizmov pridejo v telo najpogosteje z zaužitjem (oralno), velikokrat pa tudi z uporabo posebnega strupnega aparata, ki ga ima strupena žival (aktivni vnos). Toksične snovi vnesemo v organizem na štiri osnovne načine:

-injekcijski vnos

-oralni vnos

-vnos preko površine kože

-vnos preko dihalnih poti

Od nadaljne usode strupene snovi v telesu je odvisna hitrost zastrupitve in njene posledice. Injekcijski vnos je "nenaraven" in pride v poštev le pri namernem vbrizganju kemikalij v organizem, kadar strup vbrizgamo z injekcijsko iglo. Strupene živali s strupnim aparatom tudi vnesejo strup direktno v kri bodisi z ugrizom bodisi s pikom ali vbodom. Kemične snovi lahko injiciramo v organizem:

- intravenozno (i.v.)

- intramuskularno (i.m.)

- subkutano (s.c.)

- intraperitonealno (i.p.)

Le intravenozni vnos zagotavlja popolno absorbcijo vnesene snovi v organizem, pri vseh drugih vnosih pa organizem absorbira le del snovi. Intravenozen vnos je zato tudi najbolj nevaren, saj je ireverzibelen in zagotovi hitro porazdelitev snovi po organizmu. Tudi intramuskularni vnos snovi je hiter, saj so mišice dobro prekrvavljene in se tako injicirana snov hitro raznese po telesu. Absorbcija snovi pri subkutanem vnosu zagotavlja počasnejšo in manj učinkovito distribucijo, medtem ko se intraperitonealni vnos uporablja le pri biomedicinskih raziskavah, čeprav je zaradi dobre prekrvavljenosti trebušne votline tudi tu distribucija injicirane snovi v druge dele telesa dokaj hitra.

            Oralni vnos ali vnos z zaužitjem določene snovi je verjetno najpogostejši način, s katerim pridejo strupene snovi v telo. Pri oralnem vnosu ima velik pomen struktura vnešene snovi, ki odreja njeno zmožnost prehajanja preko celičnih membran. Prehod snovi preko membran je med drugim odvisen tudi od stopnje ionizacije posamezne snovi, kar je največkrat posledica pH, ta pa je v različnih delih prebavila različen.

            Nekatere snovi so škodljive, če pridejo v stik s kožo ali sluznico, saj lahko vstopajo v organizem direktno preko kože. Površinski vnos je sicer dokaj redek, ker je koža učinkovita pregrada za večino snovi. Manjše in bolj nepolarne molekule se lažje absorbirajo skozi kožo kot večje in vodotopne molekule.

            Z vdihavanjem se v organizem vnašajo predvsem plini in hlapi lahko hlapnih tekočin. Do absorbcije tako prihaja v glavnem v pljučih. Ta absorbcija ni odvisna od pH, ker plini niso ionizirane molekule, pa tudi ne od topnosti v lipidih, ker imajo alveole zelo veliko površino, stik med plinom v alveolah in kapilarami pa je zelo neposreden. Molekule plina vdrejo v kri s preprosto porazdelitvijo med plinsko in tekočo fazo, saj je parcialni tlak plina v krvi v začetku zelo nizek, kasneje pa se izenači in prehajanje plina v kri se ustavi. Kri nato zapusti pljuča in raznese molekule plina po celem telesu. V kolikor je organizem ves čas izpostavljen konstantni konc. plina, le-ta prehaja v kri toliko časa, dokler se ne vspostavi ravnotežje parcialnih tlakov v celotnem organizmu. Od tu dalje se plin, kljub nadaljni izpostavljenosti organizma, ne bo več absorbiral.

            Vnos aerosolov, ki tudi poteka prek pljuč, se od vnosa čistih plinov precej razlikuje. Aerosoli se nalagajo v dihalnem sistemu in se absorbirajo počasneje kot plini. Aerosoli, ki se ne nalagajo, se z izdihom odstranijo, zato so nevarni le tisti aerosoli, katerih delci so manjši od 100 m m. Nos zadrži večino večjih aerosolov in predstavlja učinkovito pregrado ter ščiti pljuča pred poškodbami. V pljučih se vsi delci odstranjujejo s posredovanjem makrofagov, ki pa jih v glavnem odlagajo v medcelične prostore, od koder z limfo in krvjo krožijo po telesu. Njihovo odstranjevanje je zelo počasno, zato taki delci pogosto močno škodijo organizmu.

Pogostost izpostavljenosti

            V grobem ločimo akutno (enkratno) in kronično (več kot 10% življenja posameznika) izpostavljenost strupenim snovem. Poznamo tudi subkronično izpostavljenost, ki je večkratna, a traja manj kot 10% življenja posameznika. V toksinologiji je izpostavljenost skoraj vedno le akutna, drugače pa je izpostavljenost pogosto kronična. Pri dolžini izpostavljenosti je merilo predvsem prisotnost kemične snovi v telesu oz. v določenem tkivu. Enkratna izpostavljenost lahko akumulira dovolj strupene snovi, da se pokažejo učinki zastrupitve. Večkratna izpostavljenost enaki dozi bo pripeljala do hujših zastrupitev, ker se efekti zastrupitve najpogosteje preprosto akumulirajo. Neprestana prisotnost strupene snovi bo prizadetim celicam onemogočila, da bi sproti odpravljale povzročene poškodbe, kar onemogoči ozdravitev. Ponavljujoča izpostavljenost nekaterim kemikalijam lahko povzroči drugačne simptome, kot bi jih povzročila akutna zastrupitev. Akumulacija toksičnih snovi v tkivih nam tudi razloži, zakaj enkraten stik s strupenimi snovmi pogosto ne izzove zastrupitev, podaljšana in večkratna izpostavljenost pa vodi k zastrupitvi. Kdaj se zastrupitev pojavi in kdaj ne, pa je pri večkratni izpostavljenosti odvisno predvsem od mehanizmov, ki jih ima celica na razpolago za odpravo škode. Če so obrambni mehanizmi celice oslabljeni ali če je za odpravo poškodb potreben daljši čas, je velika verjetnost, da bodo poškodbe zastrupitve trajne.

 

Doza

            Količina snovi, ki ji je določen osebek izpostavljen, je v toksikologiji zelo pomembna. Vsaka strupena snov deluje na določeno aktivno mesto, kar sproži biološki odgovor prizadetega organizma. Večja kot je količina strupene snovi na aktivnem mestu, večji je njen učinek. Odnos med količino in učinkom je lasten vsem znanim strupom. Ta odnos imenujemo razmerje med dozo in odgovorom. Grafično, je ta odnos sigmoiden z linearno odvisnostjo med 16 in 84% uporabljene doze. Kadar primerjamo učinkovitost različnih strupenih snovi, jih najpogosteje razvrstimo glede na uporabljeno dozo, ki je potrebna, da dosežemo enak biološki odgovor. Dozo najpogosteje definiramo kot tisto količino snovi, ki je potrebna, da dobimo enak biološki odgovor pri 50% izbrane testne skupine. Pri preiskušanju strupov najpogosteje definiramo dozo kot letalno dozo (LD50), to je tisto dozo strupa, ki ubije 50% osebkov v izbrani skupini. S primerjanjem LD50 (na enakih poskusnih živalih) lahko razvrstimo strupene snovi glede na njihovo jakost (bolj ko je neka snov strupena nižja je njena LD50). Zaradi zakonskih omejitev poskusov na živalih se ugotavljanje letalne doze počasi opušča in nadomešča z drugimi oblikami, kot so ID50 (inhibitorna doza), ED50 (srednja efektivna doza) itd. Te poskuse izvajamo na izoliranih sistemih, zlasti na tkivnih in celičnih kulturah, ki pa nam žal ne dajo vpogleda v totalno toksičnost neke snovi.

 

Distribucija strupov v telesu

            Raznos strupov v telesu poteka na več načinov. Ko strupena snov vdre v organizem, najprej ostane v medceličnih prostorih, ki so napolnjeni s tekočino in rahlim vezivnim tkivom. Od tu potuje po telesu s krvjo ali limfo. Limfne kapilare imajo šibak endotel zato so bolj porozne, strupena snov tako lažje vstopi v limfo kot v krvne kapilare. Ker sta limfni in krvni sistem povezana, pa vdre preko limfe tudi v krvni obtok. Strupena snov lahko vstopi tudi direktno v krvne kapilare, kar pa je odvisno od zgradbe le-teh.

            Ločimo štiri tipe kapilar, ki se razlikujejo po strukturi endotela. Kapilare s tesno povezanim endotelom preprečujejo vstop večjih molekul in ovirajo vstop hidrofilnim snovem. Take kapilare so značilne za krvno-encefalno bariero, ki preprečuje vstop številnim snovem v centralni živčni sistem. Drug tip kapilar ima endotel organiziran tako, da so med posameznimi celicami do 5 nm široki kanalčki, ki omogočajo prehod večini majhnih molekul. Take kapilare najdemo v gladkih in progastih mišicah, vezivnemu tkivu, pljučih in v maščobnem tkivu. Preko teh kapilar vstopajo v krvni obtok snovi kot so aerosoli in snovi, ki jih injiciramo i.m. ali s.c. Tretji tip kapilar ima mrežast endotel, za katerega so značilni kanalčki s premerom do 100 nm. Tak endotel imajo zlasti kapilare v črevesju in ledvicah (glomerulih). Te kapilare so močno permeabilne saj služijo za absorbcijo hrane iz črevesja in za filtracijo krvi v ledvicah. Najbolj porozen endotel srečamo pri četrtem tipu kapilar. Pri tem tipu so celice endotela nepovezane, kar omogoča prehod prek kapilarne stene celo krvnim celicam. Take kapilare so značilne za retikuloendotelialni sistem (kostni mozeg, vranica in jetra), ki sodeluje pri odstranjevanju starih in propadlih krvnih celic).

            Obseg kopičenja neke snovi v določenem tkivu je odvisen tudi od hitrosti toka krvi skozi tkivo. Velik pretok krvi imajo zlasti notranji organi, kot so jetra, možgani in ledvice. V skupino organov s srednje velikim pretokom spadajo skeletne mišice in koža, medtem ko sta med najmanj prekrvavljenimi tkivi maščobno in kostno tkivo. V najbolj prekrvavljenih tkivih se najhitreje vspostavi ravnotežje med količino snovi v tkivu in krvi.

            Številne snovi, ki vdrejo v krvni obtok se vežejo na plazemske proteine, zlasti na albumin. Ker je albumin prevelik, da bi lahko prosto prehajal skozi kapilarne stene, tudi nanj vezane molekule ne morejo z lahkoto priti v tkiva, pač pa krožijo po glavnem krvnem obtoku.

            Pri prenosu strupenih snovi imajo veliko vlogo različne pregrade (bariere), ki omejujejo prosto distribucijo snovi iz krvnega obtoka v določena tkiva. Možganska (krvno-encefalna) bariera je sestavljena iz kapilar, ki imajo tesno povezan endotel. Okrog kapilarnih sten so v možganih ovite glia celice. Molekule, ki hočejo vstopiti v kapilare morajo premagati dve oviri. Možganska bariera je prepustna za vodo, večino lipofilnih snovi, kisik in CO2, ki bariero zlahka premagajo. Le delno pa je propustna za ione in elektrolite, skoraj nepropustna pa je za večje molekule, kot so proteini, in za večino hidrofilnih molekul. Zaradi te bariere, nekatere močno toksične kovine, kot sta živo srebro in svinec, ne prizadenejo možgan odraslih ljudi. Pri otrocih pa ta bariera še ni popolnoma razvita, zato so otroški možgani bistveno občutljivejši za težke kovine. Poleg krvno-encefalne bariere poznamo še dve barieri. Bariera, ki varuje testise, onemogoča prehod večjim molekulam (npr. proteinom in polisaharidom) ter nekaterim srednje velikim molekulam v semenovode, kjer nastajajo spermiji. Najbolj prehodna je placentalna bariera, med krvnima obtokoma matere in zarodka, saj delno preprečuje prehod le velikim molekulam, npr. nekaterim proteinom.

 

Odstranjevanje strupenih snovi iz organizma

            Organizem lahko škodo, ki jo povzročijo strupene snovi zmanjša tako, da jih kemično spremeni (biotransformacija) ali pa jih preprosto izloči iz telesa.

Izločanje

            Strupene snovi se iz telesa najpogosteje odstranjujejo z urinom, ki nastaja v ledvicah, kjer glomeruli kri filtrirajo. V glomerulih se filtrira okrog 20% sestavin krvi, praktično vse molekule, katerih molska masa ne presega 60.000 Da. V renalnih tubulih se filtrirajo tudi večje molekule. Medtem, ko se voda in lipofilne molekule reabsorbirajo nazaj v krvni obtok, se v vodi topne molekule zbirajo v urinu, ta pa v sečnem mehurju.

            Nekatere snovi se iz telesa odstranjujejo tudi z žolčem. Ta nastaja v jetrih in se zliva v tanko črevo. Jetra ne filtrirajo krvi tako kot ledvice, a izločajo številne encime in druge kemične spojine, ki v žolču transformirajo razne strupene snovi, te pa se nato z blatom izločijo iz telesa. Kljub temu se vse kemične snovi v žolču ne pretvorijo in se lahko v tankem črevesu ponovno resorbirajo v krvni obtok. Eliminacija takih snovi je zato dolgotrajen proces.

            Plini se iz telesa odstranjujejo preko pljuč, a šele takrat ko se parcialni tlak dotičnega plina v pljučih zniža. Ker je parcialni tlak plina v krvi večji, bo plin začel prehajati skozi stene pljučnih mešičkov v pljuča od tu pa se izdiha v okolico.

            Strupene snovi se lahko izločajo tudi z znojem, katerega sestava je podobna sestavi plazme, le da znoj nikoli ne vsebuje beljakovin. Znoj je verjetno plazemski filtrat, ki vsebuje elektrolite in metabolne odpadke, kot so urea in mlečna kislina. Nekatere droge in kovinski ioni so tudi v znoju, čeprav ekskrecija prek znoja ni običajna pot odstranjevanja strupenih snovi iz telesa.

            Nekatere strupene snovi se izločajo tudi prek materinega mleka. Vanj vstopajo z difuzijo, kar velja le za organske lipofilne snovi. Zlasti majhne zelo nepolarne molekule se v mleku kopičijo bolj kot v plazmi.

Biotransformacija

            Biotransformacija strupenih oz. organizmu tujih snovi (ksenobiotikov) je povezana z metabolizmom. Vanjo so vključeni številni encimi, ki z encimsko katalizo kemično spremenijo strupeno ali tujo snov v tako obliko, da jo lahko organizem bodisi porabi bodisi izloči. Biotransformacija najpogosteje poteka v jetrih, ledvicah, pljučih, koži, črevesju in posteljici. Najpomembnejšo vlogo v biotransformaciji in detoksifikaciji imajo jetra. Ko se strupena snov iz črevesja absorbira v kri (oralni vnos), gre kri najprej skozi jetra, kjer pride do prve stopnje eliminacije. Biotransformacija ni popolna, zato nekaj snovi ostane v krvnem obtoku. Biotransformacija telesu tujih molekul ponavadi poteka v dveh stopnjah. V prvi stopnji pride do modifikacije ksenobiotika z adicijo določene funkcionalne skupine, kot so npr. -OH, -COO-, -NH2 ali -SH skupina. Te skupine omogočijo nadaljno povezavo ksenobiotika z neko telesu lastno molekulo. Ponavadi nastane molekula, ki je bolj vodotopna in se lažje izloči iz telesa. Kemijske reakcije, ki nastopajo v prvi stopnji detoksikacije, lahko razdelimo na oksidacije, redukcije in hidrolize. Glavni encimi, ki katalizirajo oksidativne reakcije, so P-450 monooksigenaza, razne aminoksidaze ter alkohol- in aldehid dehidrogenaze. P-450 monooksigenaza lahko katalizira tudi reduktivne reakcije, posledica delovanja tega encima pa niso vedno le manj toksične spojine, temveč pogosto celo bolj toksične spojine od izhodne snovi. P-450 monooksigenaza lahko npr. proizvede zelo reaktivne epokside, ki so za številne celice močno strupeni (napadejo DNA). Redukcijo lahko katalizirajo poleg omenjenega encima predvsem aldehid/keton reduktaze. Hidrolitični encimi so epoksid hidrolaze, esteraze in amidaze, encimi, katerih posledica delovanja je nastanek ustreznih spojin s hidroksilno, karboksilno ali amino funkcionalno skupino.

            V drugi stopnji detoksikacije se modificirana tuja spojina veže z neko telesu lastno spojino, kar ima za posledico nastanek nove spojine, ki je ponavadi zelo vodotopna in se bistveno lažje izloči iz telesa. Telesu lastne spojine, ki so najpogosteje udeležene pri odstranjevanju ksenobiotikov so: glutation, glukuronska kislina, aminokisline in sulfat. Konjugacija glukoronske kisline s hidroksilnimi, karboksilnimi, amino in sulfhidrilnimi skupinami vodi k nastanku kisika, dušika ali žveplovih spojin s solmi glukoronske kisline. Konjugacija z glutationom vodi k nastanku konjugatov oz. derivatov merkapturne kisline, ki se nato izločajo preko ledvic ali preko jeter ali prek obeh organov. Bistvo nastanka konjugatov je v tem, da se v nepolarno molekulo uvede bolj polarna skupina (najpogosteje karboksilna), kar poveča njeno vodotopnost. Dva tipa reakcij ne povečata topnosti (acetiliranje in metiliranje), ker vodita k zvečanju nepolarnosti molekule in zmanjšnju topnosti. Acetiliranje je včasih ugodno za odstranjevanje snovi z amino skupino, ker ponavadi zmanjša njihovo toksičnost.

 

Terapevtski, toksični in letalni učinek

            Ker je učinek neke snovi odvisen od doze, velja staro Paracelsusovo pravilo, da je prav vsaka snov lahko strup. V medicini in veterini se snovi uporabljajo v takih količinah, da imajo le-te koristen oz. zdravilen učinek. Če je odmerek (doza) prevelika lahko pride do različnih toksičnih učinkov in v določenih primerih celo do smrti organizma. Razmerje med dozo in učinkom lahko prikažemo grafično. Dobimo značilno sigmoidno krivuljo, ki je odvisna od doze. Ponavadi imamo na grafu tri krivulje, ki prikazujejo odgovor glede na uporabljeno dozo. Kadar se krivulje, ki opisujejo terapevtski, toksični in letalni učinek nikjer ne prekrivajo, je uporabljena snov varna za uporabo. Relativno varnost uporabe določene snovi izražamo s terapevtskim indeksom. Ta je enak razmerju med dozo, ki povzroči 50% smrtnost pri populaciji poskusnih osebkov (LD50), in dozo, ki ima na 50% testirane populacije zdravilen učinek (TD50). Večje kot je število terapevtskega indexa bolj je neka snov varna za uporabo.

 

Potek zastrupitve

            Strupene snovi lahko povzročijo različne oblike odgovora (znake zastrupitve) zastrupljenega organizma. Delimo jih glede na mesto, kjer se pojavijo, čas, ki je potreben, da pride do zastrupitve, znake zastrupitve ter morfološke in/ali fiziološke spremembe v zastrupljenem organizmu. V večini primerov strupena snov povzroči v določenem organu morfološko poškodbo, ki se odraža tudi v delovanju prizadetega organa ali tkiva. V nekaterih primerih strupena snov povzroči le motnje v delovanju nekega organa, kar pa ne privede do morfoloških sprememb (značilen primer je silikoza pljuč). Številni strupi, npr. acetilholinesterazni inhibitorji, delujejo le na encim in tako povzročijo le fiziološko motnjo, ne pa tudi spremembe v tkivu ali organu.

            Znaki zastrupitve so lahko omejeni le na določen del telesa (lokalno delovanje) lahko pa so sistemski in prizadenejo celoten organizem. Strupi, ki delujejo lokalno, najpogosteje povzročijo spremembe, ki nastanejo na mestu vdora strupene snovi v telo.

            Strupene snovi lahko povzročijo takojšen ali zapoznel odziv organizma na strupeno snov. Takojšen odziv pomeni odziv, ki nastane do nekaj dni po stiku s strupeno snovjo, zapoznel odziv pa pomeni zastrupitev, ki se pojavi šele po več kot nekaj dneh. Natančna meja pravzaprav ne obstaja in je vsaj delno odvisna tudi od posameznika. Pojav zastrupitve je odvisen od že omenjenih dejavnikov, kot so hitrost biotransformacije, hitrost absorbcije, distribucije in hitrost izločanja strupene snovi, kot tudi od hitrosti njenega delovanja na tarčni organ.

            Zastrupitev je lahko reverzibilna ali ireverzibilna. Pri revezibilni zastrupitvi se organizem opomore in s popravljalnimi mehanizmi odpravi posledice zastrupitve. Ireverzibilna zastrupitev pa po navadi pomeni smrt ali vsaj trajno poškodbo, s čimer je moteno normalno delovanje organizma.

 

Imunski odgovor

            Imunski sistem varuje telo proti tujim snovem ali antigenom. Če vdre antigen v telo, se organizem brani s kombinacijo humoralnega in celularnega imunskega odgovora. Poti vnosa strupene snovi v telo, ki so počasne, navadno najprej izzovejo celularni imunski odgovor, medtem ko vnos tuje snovi v kri navadno izove humoralni imunski odgovor. V celularni imunski odziv so vpleteni fagociti (makrofagi, nevtrofilni in eozinofilni levkociti), ki antigene preprosto obdajo s svojo citoplazmo. T-limfociti, ki nastajajo v timusu, pa imajo specifične receptorje za določene antigene. Celularna imunost ima velik pomen pri obrambi organizma pred tumorji in infekcijami. Makrofagi fagocitirajo antigene in izločajo posebne proteine (monokine ali citokine). Tak protein je npr. interlevkin-2, ki ojača imunski odgovor, tako da stimulira nastajanje novih limfocitov T. Na takih limfocitih se nato pojavijo posebni receptorji za specifičen antigen. Ker so limfociti T dolgoživeče celice (več mesecev ali celo let), je celična imunost tako ohranjena za daljše obdobje. Kadar pridejo taki limfociti v ponovni stik z znanim antigenom, ga prepoznajo in začno izločati lastne proteine, t.i. limfokine, ki stimulirajo fagocite, da uničijo antigen. Kadar so antigeni locirani na tumorskih celicah, jih nekateri citotoksični limfociti-T prepoznajo in tako ubijejo tuje ali tumorske celice.

Humoralna imunost brani organizem pred tujimi snovmi s protitelesi (imunoglobulini). Imunoglobuline proizvajajo limfociti B, ki nastajajo v vranici, bezgavkah in drugod v limfi. Limfociti B so sestavni del krvne plazme, kjer proizvajajo protitelesa. Poznamo pet vrst protiteles (IgG, IgM, IgA, IgD in IgE). Prvi trije sodelujejo pri humoralni imunosti, vloga IgD ni popolnoma znana, IgE pa so protitelesa, ki imajo velik pomen pri alergičnih reakcijah (hipersenzibilnost ali preobčutljivost). Protitelesa vežejo antigene in jih navadno oborijo, nato pa jih fagociti odstranijo. Protitelesa tudi sprožijo delovanje komplementa, ki ojača precipitacijo in tudi lizira tuje celice.

            Čeprav je imunski sistem namenjen obrambi organizma, pa so določeni mehanizmi imunskega sistema za posameznika lahko škodljivi. Alergija ali preobčutljivost je posledica delovanja IgE proti določenim antigenom, kar ima za organizem škodljive posledice. Snovi, ki povzročajo preobčutljivost imenujemo alergeni. Alergičen odgovor organizma se od klasične zastrupitve loči na tri načine. Alergičen odgovor nikoli ne nastane ob prvem stiku z antigenom (alergenom), razen v redkih primerih, ko je posameznik predhodno prišel v stik z alergenu zelo podobno snovjo (npr. alergičnost na penicilin lahko pomeni tudi alergičnost na druge, penicilinu podobne antibiotike). Alergija je drugače vedno specifična tako glede na alergen kot na posameznika. V nasprotju s strupenimi snovmi, ki imajo univerzalno delovanje, odvisno le od doze, pa je delovanje alergenov neodvisno od doze, a prizadene le razmeroma majhen del populacije. Količina, ki je potrebna, da nastane alergičen odgovor, je navadno dosti manjša od količine strupene snovi, ki je potrebna za nastanek klasične zastupitve.

            Poznamo štiri vrste hipersenzibilnega odgovora. Najpogostejša oblika alergije je hipna alergija, sledijo citotoksična oblika, imunska oblika in zakasnjena oblika. Hipna alergija ali anafilaksija je posledica delovanja IgE, ki se vežejo na antigene predhodno senzibiliziranih bazofilcev. Ob ponovnem stiku z alergenom, se bazofilci senzibilizirajo in izločajo mediatorja histamin ter serotonin. Mediatorji pokrčijo gladke mišice respiratornih poti ter širijo žile, kar vodi k padcu krvnega pritiska in v anafilaktični šok. Poveča se prehodnost kapilar, zaradi česar pride do pojava obsežnih oteklin in rdeče kože. Anafilaksija se pojavi praktično v nekaj minutah po vdoru alergena v telo. Anafilaksija je lahko lokalna ali pa sistemska, slednja vedno vodi v anafilaktični šok, ki je smrtno nevaren.

            Citotoksična hipersenzibilnost ima drugačen potek in se razvije postopoma. V ta tip alergije niso vključena protitelesa IgE, pač pa IgG in IgM. Ta protitelesa se lahko vežejo na nove antigene določenih celic, kar vodi k aktivaciji komplementa in lizi prizadetih celic. Če so prizadeti eritrociti pride do anemij, če so prizadeti trombociti pride do motenj pri strjevanju krvi, itd.

            Tretja oblika alergije je oblika, kjer pride do precipitacije alergenov z IgG, kar vodi k aktivaciji komplementa, to pa na nekaterih mestih povzroči vnetja (značilen primer je glomerulonefritis ali vnetje ledvičnih čašic).

            Zakasnjena oblika hipersenzitivnosti se razlikuje od drugih oblik alergije, ker vanjo ni pletena humoralna imunost. Ob ponovnem srečanju z alergenom limfociti T sproščajo limfokine, ki sprožijo niz vnetnih reakcij. Najpogostejša oblika takih vnetij je alergični kontaktni dermatitis.

 

Vpliv toksičnih snovi na razvoj in rast organizma

            Strupene snovi lahko vplivajo na organizem tako, da povzročijo nenormalen razvoj zarodkov, sprožijo procese, ki vodijo k nastanku rakastih obolenj, ali povzročijo napake v dednem materialu. Tako govorimo o:

-teratogenih učinkih

-kancerogenih učinkih

-mutagenih učinkih

 

Teratogeneza

            Teratogeneza je učinek strupenih snovi na zarodek, kar ima za posledico napake v morfološkem in/ali fiziološkem razvoju zarodka. Teratogeni učinki lahko vodijo k smrti zarodka že v maternici, ali pa inducirajo nastanek rakastega obolenja, ki se pokaže ob rojstvu. Od stopnje v razvoju zarodka je odvisno, koliko je zarodek občutljiv za različne teratogene učinke. V zgodnjem obdobju razvoja teratogene snovi navadno povzroče smrt zarodka, v poznejših stopnjah razvoja pa pride do nastanka različnih malformacij, ki v nekaterih primerih predstavljajo letalno okvaro. Najpogosteje pride do nastanka malformacij v prvih treh mesecih razvoja, ker je to obdobje organogeneze.

            O teratogenih mehanizmih vemo malo, verjetno pa nekatere teratogene snovi preprosto ubijejo določeno število zarodkovih celic. Teratogeni lahko vplivajo tudi na mater, kar vodi k zmanjšanju preskrbljenosti zarodka s kisikom, posledica pa je nastanek malformacij. Morda najbolj znana snov z teratogenimi učinki je talidomid, ki so ga v 60 letih dajali nosečnicam, da bi preprečili slabost in bruhanje v prvih mesecih nosečnosti. Talidomid je najpogosteje povzročil hude okvare predvsem v razvoju zgornjih okončin. Primer talidomida je povzročil, da je danes obvezno testiranje zdravil na teratogenost.

 

Kancerogeneza (karcinogeneza)

            Kancerogene snovi so snovi, ki lahko povzročijo rast raznih tumorjev in drugih novotvorb. Pri nastanku tumorjev pride do nenadzorovane rasti celic, ker se porušijo regulatorni mehanizmi. Novotorbe so lahko benigne ali maligne. Pri benignih tumorjih je rast do določene mere še nadzorovana, zato taki tumorji ohranijo neke vrste celično organiziranost in rastejo razmeroma počasi. Rast malignih tumorjev pa je skoraj popolnoma nenadzorovana, ker celice preprosto "podivjajo", rastejo neorganizirano in zelo hitro. Benigni tumorji so obdani z vlaknasto ovojnico in zato ne napadajo okolišnjih tkiv, kar je značilno za maligne tumorje. Benigni tumorji rastejo na enem mestu, maligni tumorji pa se lahko razsejejo po celem telesu (metastaze). Metastaze nastajajo tako, da se rakaste celice razširijo po krvnem ali limfnem obtoku in uničijo celice in tkiva daleč proč od primarnega tumorja. Karcinogeneza je zapleten proces, v katerega so vpleteni številni dejavniki. Številni zunanji dejavniki, kot so npr. kajenje, prekomerno uživanje maščob, ter trajna izpostavljenost nekaterim kemikalijam, pripomorejo k nastanku nekaterih malignih obolenj. Notranji dejavniki, kot so porušeno hormonsko ravnotežje, imunosupresija in dolgotrajen stres, lahko sprožijo nastanek rakastega obolenja. Občutljivost na kemično kancerogenezo je odvisna od posamezne vrste. Znane so številne kancerogene spojine, med drugim tudi nekateri citostatiki (doza-odgovor!), številne aromatske spojine, spojine, ki vsebujejo nitro skupino, kovine, izotopi, in številne druge organske spojine. Nastanek tumorjev ni popolnoma pojasnjen, predvideva pa se, da večina kancerogenih snovi povzroči okvaro DNA. Ker je DNA tista molekula, ki nadzoruje delovanje celice, je logično, da se bo okvara DNA odrazila tudi pri rasti celic, ki se začno kaotično deliti. Snovi, katerih delovanje poškoduje DNA poskusnih živali in ima za posledico nastanek tumorjev imenujemo genotoksični kancerogeni.

 

Mutageneza

            V ožjem smislu je mutageneza sprememba v genetskem materialu, ki jo izovejo zunanji dejavniki ali genotoksini. Če gen mutira, to vodi k prenosu mutacije ob delitvi celice na nove celice. Nekatere od teh mutacij celice lahko popravijo, ne pa vseh. V somatskih celicah mutacije navadno prizadenejo le nekaj celic, ki odmrejo in se to organizmu ne pozna. V nekaterih primerih mutirane celice "podivjajo", kar vodi k nastanku rakastega obolenja. Če pride do mutacij v spolnih celicah, so posledica napake v razvoju zarodka, nastanejo malformacije ali pa pride do spontanih splavov.

 

Vrste toksičnih snovi

            V današnji civilizaciji nas strupene snovi obdajajo praktično na vsakem koraku in so žal del našega vsakdana. Strupene snovi ločimo na različne skupine glede na to kaj je njihova glavna uporabnost:

- strupene snovi, ki se uporabljajo v kmetijstvu in industriji (pesticidi in organska topila)

- zdravila in druga sredstva v medicini

- izotope

- toksini naravnega izvora (živalski, rastlinski in mikrobni strupi ali biotoksini)

V skupino kmetijskih in industrijskih strupov spadajo številne snovi, ki se uporabljajo za zatiranje škodljivcevi in različnih plevelov. Imenujemo jih pesticidi. Med pesticide prištevamo insekticide, rodenticide, fungicide, herbicide in fumigante ali nematocide.

 

Pesticidi

Insekticidi

Razdelimo jih v štiri glavne skupine:

- organofosfati

- karbamati

- klorirani ogljikovodiki

- naravni insekticidi iz rastlin (npr. piretrum iz bolhača)

            Organofosfati in karbamati so ireverzibilni inhibitorji acetilholinesterae. Njihova toksičnost je izredno velika, saj se nekatere od teh snovi uporabljajo tudi kot bojni strupi (npr. soman, sarin in tabun). Naštete snovi preprečijo delovanje AChE, kar zveča nivo acetilholina v sinaptični špranji in povzroči hude motnje v prenosu živčnega vzburjenja. Posledice so slinjenje, solzenje, nekontrolirano izločanje urina in blata, trzanje skeletnih mišic ter v primerih hudih zastrupitev smrt zaradi prekinitve dihanja. Nekateri insekticidi so specifični le za insektni tip AChE, drugi pa so metabolni inhibitorji, ki delujejo kot inhibitorji šele takrat, ko se v organizmu biotransformirajo. Tak insekticid je malation, ki se v insektih biotransformira v toksični malaokson, pri sesalcih pa hidrolizira v netoksični malation diacid, ta pa se konjugira in izloči iz organizma. Drug insekticid - paration pa ni tako nedolžen, saj je bil v preteklosti vzrok za številne zastrupitve pri ljudeh.

            Klorirani ogljikovodiki, ki jih uporabljamo kot insekticide (npr. klorofenotan, aldrin, heptaklor in DDT - začeli so ga z velikim uspehom uporabljati za zatiranje malarije), so večje molekule kot klorirani ogljikovodiki, ki jih uporabljamo kot organska topila (npr. kloroform). Prvi stimulirajo centralno živčevje, drugi ga blokirajo. Večina insekticidov, ki so narejeni na osnovi kloriranih ogljikovodikov deluje tako, da povzročijo nezavest. DDT je za človeka neposredno toksičen le v večjih konc (10mg/kg), verjetno deluje na transport Na+ in K+ v senzoričnih in motoričnih živčnih vlaknih ter na motorični korteks oz. na mehanizme, ki uravnavajo energetski metabolizem potreben za ta transport. DDT je danes prepovedan v številnih deželah, ker ima negativen vpliv na okolje, saj se kopiči v prehranjevalnih verigah in je tudi kancerogena snov. DDT je zelo topen v maščobah zato se akumulira v maščobnem tkivu rib in ptic, kjer lahko ostane zelo dolgo kot biotransformiran metabolit imenovan DDE (dikloro-difenil-trikloroetan). Pri ptičih vpliva na debelino jajčne lupine, ki postane krhka, to pa ima za posledico manjše preživetje in upad ptičje populacije.

            Naravni insekticidi, kot so piretrini, so insektno specifični, imajo kratko razpolovno dobo in človeku niso škodljivi, čeprav včasih lahko povzročijo pri nekaterih posameznikih razne alergije. Rotenon, ki je prav tako insekticid rastlinskega izvora, je inhibitor dihalne verige, šibek iritant in živalski kancerogen.

 

Herbicidi

            Uporabljajo se v kmetijstvu za zatiranje plevela. Med herbicide uvrščamo snovi kot so klorirani fenili, dinitrofenoli, bipiridili, karbamati, triazini, aromatski amidi itd. Njihova toksičnost za človeka večinoma ni velika, vendar lahko nekateri v večjih dozah povzročajo znake zastrupitve tudi pri ljudeh. 2,4-D lahko povzroča mišične in živčne motnje. T. i. "agent orange", ki je defoliant in so ga Američani uporabljali med vietnamsko vojno, je mešanica 2,4-D in 2,4,5-T. Slednji je bil kontaminiran s tetraklorodibenzodioksinom ali dioksinom. Ta snov je zelo toksična za nekatere živali in je pri laboratorijskih živalih kazala teratogene učinke. Pri človeku povzroča izpuščaje oz. klorakne, ki se najpogosteje pojavljajo med očmi in ušesi. Podobne učinke imajo tudi poliklorirani bifenili (PCB).

            Verjetno najbolj razvpit herbicid v humani toksikologiji je parakvat. V 20. letih je bila ta snov odgovorna za nekaj sto primerov zastrupitev ljudi s smrtnim izidom. Zanimivo je, da do zaužitja parakvata ni prihajalo zaradi slučajne kontaminacije hrane ali zastrupljanja okolja, pač pa so ga na veliko uporabljali samomorilci in morilci. Parakvat je kontaknti herbicid, ki se močno veže na delce prsti. Iz zemlje se torej ne izspira in deluje le na rastline, ker inhibira fotosintezo. Toksičen je tudi za živali, ki pridejo z njim v direktni stik, čeprav mehanizem delovanja v živalih ni pojasnen. Oralno zaužitje parakvata vodi pri človeku v skoraj gotovo smrt, ali pa vsaj k težkim poškodbam pljuč in ledvic. Pljuča so najbolj prizadeta, ker selektivno kopičijo parakvat, kar povzroči toksične učinke v pljučnih mešičkih. Koncentracija parakvata v pljučih je nekajkrat večja od tiste v plazmi. Pljuča kopičijo parakvat zaradi strukturne podobnosti z biološkimi diamini in poliamini, kot sta npr. putrescin in spermin. Intramolekularna razdalja med dvema atomoma dušika v molekuli parakvata le-temu omogočita kopičenje v pljučih zaradi selektivnega aktivnega transporta, ki ga sicer najdemo le še v možganih, čeprav ti parakvata ne kopičijo. Parakvat je toksičen zato, ker ga organizem pretvori v prosto radikalno obliko, ta pa je stabilna. Nastane z encimsko eno-elektronsko redukcijo (donor e- je NADPH). S kisikom da nato superoksidni anion, ob tem pa se parakvat povrne v kationsko obliko. Tako se redoks cikel nadaljuje, kar generira nove in nove radikale in porablja NADPH. Superoksid vodi k nastanku vodikovega peroksida in hidroksilnih radikalov, ki so zelo reaktivni in povzročajo peroksidacijo lipidov. Zaradi tega nastanejo nove metabolne motnje. Parakvat tako povzroči progresivno pljučno fibrozo, poškoduje pa tudi ledvice (parakvat iz plazme). Za zastrupitev s parakvatom ni protistrupa. Umiranje je dolgotrajno in boleče, smrt nastopi nekaj dni do enega tedna po zastrupitvi.

 

Rodenticidi

            Varfarin se uporablja za zatiranje glodalcev, čeprav so ga v začetku uporabljali za zdravljenje tromboembolij. Varfarin preprečuje strjevanje krvi in zato povzroča notranje krvavitve.

 

Zdravila

Zdravniki nas pitajo z zdravili, o katerih vedo malo, še manj vedo o naših telesih, in sploh nič o boleznih, ki bi naj jih zdravili.

                                                                                                Voltaire

            Zdravila naj bi seveda zdravila ljudi in živali, čeprav se pogosto zgodi, da imajo prav nasprotne, škodljive učinke. Ti se pokažejo najpogosteje ob napačni uporabi zdravila. Toksičnost zdravil se odraža na raznih nivojih. Stranski učinki nekega zdravila se pojavljajo tudi ob pravilni uporabi zdravila, vendar je njihov vpliv na organizem normalno manj škodljiv kot so zdravilni učinki koristni. Pri pretirani uporabi (preseženi dozi) lahko pride do akutnih zastrupitev, pri normalnih dozah pa se včasih pojavijo kontraindikacije, ki so velikokrat povezane z hkratno uporabo drugega zdravila. Poznamo tudi tabletomanijo, ki vodi h kronični odvisnosti od določenega zdravila. Mehanizmi toksičnega delovanja zdravil so:

- neposredna in predvidena toksičnost zaradi inhibicije določenih metabolnih poti, po navadi povezana s prekoračitvijo doze (tip 1).

- toksičnost, ki je posledica dolgotrajnejše uporabe nekega zdravila in se odraža kot motnja v metabolizmu, bodisi kot posledica farmakološkega ali imunskega učinka (tip 2).

- neposredni, toda nepredvideni učinek po eni sami terapevtski dozi, kar je navadno posledica posebnega individualnega metabolizma ali neznanega farmakološkega odziva (tip 3).

- toksični učinek zaradi kombinacije uporabljenega zdravila (kontraindikacije) z neko drugo tujo snovjo v organizmu (tip 4).

Nekaj primerov:

Paracetamol (tip 1)

            Zdravila se pogosto zlorabljajo za samomore, v Veliki Britaniji registrirajo na leto kar 300 samomorov s paracetamolom. Paracetamol je razmeroma šibak analgetik, ki je v normalnih dozah popolnoma neškodljiv (do 500 mg). Z zaužitjem 15 do 20 tablet pa pride do često usodne poškodbe jeter. Ker poznamo mehanizem delovanja, na srečo poznamo tudi antidot proti zastrupitvi z paracetamolom. Paracetamol se v organizmu metabolizira tako, da pride do konjugacije s sulfatom ali glukuronsko kislino, le manjši del se pretvori z mikrosomalno oksidacijo s posredovanjem monooksigenaz. Produkt, ki nastane je toksičen, vendar se večinoma razstrupi z glutationom. V kolikor pa je doza paracetamola prevelika, se ta metabolna shema poruši, saj sulfata za konjugacijo preprosto zmanjka. Tako se paracetamol v glavnem metabolizira z monooksigenazami, kar vodi k nastanku toksičnega produkta, za katerega pa ni dovolj glutationa. Zaradi tega toksični produkt reagira z jeternimi proteini, to pa vodi k nekrozam jetrnega tkiva. Uspešna antidota proti zastrupitvi s paracetamolom je N-acetilcistein, ki pa ga moramo dati zastrupljeni osebi oralno ali intravenozno vsaj 10-12 ur po zastrupitvi.

Hidralazin (tip 2)

            Normalna terapevtska doza hidralazina povzroča pri številnih pacientih stranske učinke. Primer hidralazina je pomemben, saj kaže na pomembnost kombiniranja različnih dejavnikov, ki vodijo k stranskim učinkom zdravila. Hidralizin je antihipertonično sredstvo, ki pa povzroča lupus eritrematosus, bolezen nekoliko podobno revmatičnemu artritisu. V petdesetih letih, ko so začeli uporabljati to zdravilo, so se stranski učinki pojavili pri okrog 10% pacientov. Uporabljene doze pa so bile precej visoke, zato so uporabo hidralizina najprej opustili, nato pa začeli le zmanjševati doze. Kljub temu se tudi ob manjših dozah hidralizina stranski pojavi odrazijo pri 6-7% pacientov. Raziskave so pokazale, da na pojav stranskih učinkov vplivajo:

-doza

-acetilatorski fenotip

-HLA tip

-spol

-trajanje terapije

Vpliv doze smo že omenili, stranski učinki se pojavijo pogosteje, če uporabljamo doze okrog 800 mg zdravila/dan. Danes zato uporabljajo doze do 200 mg/dan, kar pa stranskih pojavov v 5-10% še vedno ne prepreči. Hidralazin organizem biotransformira v fazi 2 z acetiliranjem, kar je normalna pot transformacije za ksenobiotike z amino, sulfonamidno ali hidrazinsko skupino. Acetiliranje je genetsko nadzorovan proces, ki pa v človeški populaciji obstaja v hitri in počasni fenotipski obliki. Hidralazin povzroča stranske učinke skoraj isključno le v skupini ljudi s počasnim fenotipom. Pri počasnih acetilatorjih je več možnosti za imunski odziv organizma ali pa biotransformacija poteka prek monooksigenaz. Razlike v tipu tkiva (HLA) so pri razvoju stranskih pojavov prav tako pomembne, saj je pogostost lupusa pri ljudeh s tipom tkiva DR4 več kot 2x večja. Spol prav tako vpliva na razvoj stranskih pojavov, pogostost obolenja je dvakrat večja pri ženskah. Trajanje terapije s hidralazinom je pomemben dejavnik za pojav stranskih pojavov, saj moramo dajati zdravilo v povprečju 18 mesecev, da pride do stranskih pojavov. Hidralazin je torej zdravilo, ki povzroča stranske pojave zaradi imunoloških ali alergičnih procesov v občutljivem posamezniku.

Halotan (tip 3)

            Halotan je anastetik, ki pri določenih posameznikih zelo redko povzroči t.i. idiosinkratično reakcijo. Ta se pojavi pri enem od 10.000 do 100.000 pacientov in lahko povzroči hudo okvaro jeter, čeprav ta po navadi ni usodna. Za idiosinkratično reakcijo obstajajo sledeče predispozicije:

- večkratna izpostavljenost, ki senzibilizira pacienta

- spol (ženske so bolj občutljive)

- pretirana debelost

- alergija v anamnezi pacienta

Halotan verjetno povzroči resno okvaro jeter preko imunskega mehanizma, kjer zaradi večkratne izpostavljenosti halotanu nastajajo protitelesa proti spremenjenim membranam jetrnih celic. Celularni imunski odgovor (limfociti T) ubijejo spremenjene jetrne celice, kar povzroči hepatitis. Milejše okvare so verjetno posledica direktne toksičnosti enega izmed halotanskih metabolitov v jetrih. Narave halotanskih antigenov in toksičnih produktov biotransformacije ne poznamo.

Pomanjkanje glukoze-6-fosfat dehidrogenaze (tip 3 & 4)

            Pomanjkanje tega encima je redko, a je osnova za pojav idiosinkrazije ob uporabi določenih zdravil. Pomanjkanje G6PDH, ki je eden izmed glavnih encimov v poti pentoze-fosfata, je pomemben za vzdrževanje nivoja NADPH v eritrocitih. NADPH je potreben za vzdrževanje potrebne količine reduciranega glutationa, ki rdeče krvničke varuje pred oksidanti, ti pa so velikokrat metaboliti različnih zdravil. Posamezniki, ki nimajo G6PDH trpijo za akutnimi hemolitičnimi anemijami, kadar jemljejo npr. antimalarična sredstva kot je primakvin ali pa pridejo v stik s ksenobiotiki anilinskega tipa. Popolna odsotnost G6PDH je sicer zelo redka, pomanjkanje je navadno posledica določenih sprememb v strukturi encima, ki povzroči njegovo nefunkcionalnost. Tako pomanjkanje je tipično za eritrocite, zato so ti najbolj prizadeti. Pomanjkanje ali nefunkcionalnost encima sta dedni in se prenašata na X kromosomu, čeprav je sam mehanizem dedovanja dokaj zapleten. Dajanje primakvina osebam s pomanjkanjem G6PDH je torej kontraindikatorno.

            Večino zdravil, ki imajo toksične učinke uvrščamo med analgetike, kot sta npr. aspirin in acetaminofen. Aspirin vpliva na oksidativno fosforilacijo in povzroči, da celice preklopijo svoj metabolizem tako, da se večji del kemične energije pretvarja v toploto in ne v ATP. Posledica je dvig telesne temperature, dehidracija in žeja. Asprin tudi znižuje pH in vpliva na centralni živčni sistem. Narkotični analgetiki kot je morfij, delujejo na centralni živčni sistem. Ob prekomernih dozah povzročajo zadušitev, ker omrtvičijo možganski dihalni center.

Druga velika skupina sredstev, ki često vodijo k namernim ali nenamernim zastrupitvam so pomirjevala in uspavala. Večinoma vplivajo na centralni živčni sistem. Nekateri barbiturati imajo nizek terapevtski indeks, zato lahko pride do prekoračitve doze zelo hitro.

Antipsihotiki so zdravila se uporabljajo v psihiatriji in imajo dokaj velik terapevtski indeks, ob prekoračitvi doze pa lahko blokirajo parasimpatično ali simpatično živčevje.

 

Industrijske kemikalije in industrijska toksikologija

            Izpostavljenost ljudi, ki delajo v kemični industriji raznim toksičnim snovem, je vzrok za nekatere akutne in številne kronične zastrupitve.

Nekaj primerov:

Vinil klorid (CH2=CHCl) je osnova za proizvodnjo plastičnih mas (PVC)

Vinil kloridna narkoza je akutna zastrupitev, kronično zastrupitev pa imenujemo vinil kloridni sindrom in se odraža kot posebno rakasto obolenje jeter-hemangiosarkom, s spremembami v kostnem in kožnem tkivu (predvsem zaradi motenj v prekrvavitvi) in s poškodbami jeter v obliki fibroz.

            Vinil klorid se v organizmu biotransformira v reaktivna intermediata kloroetilen oksid in kloroacetaldehid. Intermediata alkilirata verige DNA, posledica je verjetno nastanek rakastega obolenja. Metabolni produkti se povezujejo s celičnimi proteini, temu pa sledi imunski odgovor in poškodbe tkiva.

Aromatski amini

            Uporabljajo se v gumarski industriji in industriji barvil. Odgovorni so za številne toksične učinke. b -naftilamin je eden redkih karcinogenov, ki povzroča rak na sečnem mehurju. To spojino že dolgo ne uporabljajo več, vendar služi kot modelna substanca za razvoj raka.

Potek procesa:

1. hidroksilacija in konjugacija z glukoronsko kislino

2. konjugiran produkt je topen in se v urinu zbira v sečnem mehurju

3. zaradi kislega pH v sečnem mehurju razpade v reaktivni metabolit

4. reaktivni metabolit se veže na DNA in jo poškoduje

5. genotoksičnost povzroči transformiranje epitelnih celic mehurja in nastane rak

Azbest

            Azbest je kemično inerten material, ki pa je zelo toksičen. Azbest je pravzaprav zmes različnih mineralnih silikatov. Projekcija smrtnosti zaradi različnih oblik raka povezanega z azbestozami od leta 1983 za naslednjih 30 let:

-VB 3000/leto

- ZDA 10000/leto

- Slovenija (50?)

Kronična izpostavljenost azbestu vodi k:

- azbestoza ali pljučna fibroza

- benigna obolenja plevre

- bronhialni karcinom

- maligni mezoteliom

            Delce azbesta (zlasti nevarni so delci daljši od 10-20 m m, saj teh makrofagi ne morejo fagocitirati), ki pridejo v pljuča obda poseben protein, ki vsebuje železo, med delci pa je veliko kolagenskih vlaken. Sama azbestna vlakna so kemično inertna, vendar lahko povzročajo lizo eritrocitov. Posledica kronične izpostavljenosti azbestu je najmanj pljučna fibroza. Zaradi spremenjene in poškodovane površine makrofagov pa pride tudi do spremembe receptorjev za C3 faktor komplementa in za IgG protitelesa, kar aktivira komplement.

Kadmij

            Kadmij je težka kovina, ki ga na široko uporabljajo pri pridobivanju raznih zlitin, v proizvodnji baterij, v industriji raznih barvil in lakov, plastike, umetne gume itd. Kadmij je zelo toksična kovina, zlasti nevarno je vdihavanje kadmijevega oksida. Preko pljuč se absorbira okrog 40% vdihanega kadmija, absorbcija preko črevesne sluznice pa je razmeroma slaba. Kadmij povzroča zlasti okvare ledvic, kar je posledica kronične izpostavljenosti, akutna izpostavljenost pa povzroči poškodbe testisov. Poškodbe se ob kronični izpostavljenosti pojavijo na ledvicah z zakasnitvijo v glavnem zato, ker se kadmij veže na poseben nizkomolekularen protein - metalotionein, ki v telesu skrbi za transport cinka. Le-ta je kadmiju zelo podoben, zato se kar 80-90% kadmija in vivo veže na omenjeni protein. Tak proteinski kompleks se nato transportira v ledvice, kjer se filtrira skozi glomerule in reabsorbira v proksimalne tubule, kjer proteinaze kompleks razgradijo in sprostijo kadmij, ta pa poškoduje celice. Akutna zastrupitev povzroči že po nekaj urah nekrozo testisov, degeneracijo in popolno izgubo spermijev. To je posledica toksičnega delovanja kadmija na ožilje, ki obdaja testise. Kadmij zmanjša prekrvavitev in preskrbo s kisikom, torej je njegova akutna toksičnost povezana ne toliko z metabolizmom kot s fiziološkimi procesi. Polovična razpolovna doba kadmija je v telesu od 7-30 let. Izloča se preko ledvic in jih tako poškoduje. Kadmij vpliva tudi na metabolizem kalcija, kar privede do izgube kalcija in hudih osteoporoz (krhkih kosti). Bolezen je znana na Japonskem, kjer je prišlo do številnih zastrupitev z rižem kontaminiranim s kadmijem (bolezen Itai-Itai ali po slovensko Av-Av).

 

Aditivi v prehrambeni industriji

V prehrambeni industriji se uporabljajo številni aditivi, ki so v velikih dozah lahko toksični

Nekaj primerov:

-barvila                                                 tartrazin

-antioksidanti                                        butiliran hidroksitoluen

-stabilizatorji                                         rastlinski lateksi

-arome                                                 cinamaldehid

-prezervativi                                         natrijev nitrat

-emulgatorji                                          polioksietilen sorbitan ester maščobnih kislin

-kisline/baze                                         citronska kislina, askorbinska kislina

-pufri                                                    karbonat

-belila                                                   benzoilperoksid

-pogonska sredstva                              dušikov oksidul

-umetna sladila                          saharin

-snovi za izboljšanje okusa                    natrijev glutamat

V prehrambeni industriji danes uporabljamo prek 2500 aditivov. Čeprav naj bi bili ti aditivi neškodljivi, pa dejansko temu ni tako, saj je vsaj nekaj takih, ki imajo tudi škodljive učinke. Dokazovanje toksičnosti je za posamezen aditiv težavno.

            Prezervativi se uporabljajo za zaščito pred bakterijskimi okužbami hrane in so večinoma koristni, medtem ko se razna barvila dodajajo le zato, da proizvajalec izboljša organoleptične lastnosti izdelka, sama barvila pa so lahko škodljiva. Tudi umetna sladila kot je saharin so lahko škodljiva in so jih v nekaterih državah že prepovedali. Oglejmo si torej nekaj primerov:

Tartrazin

            Tartrazin je splošno razširjeno barvilo, ki se ga dodaja določenim izdelkom in ima v Evropi oznako E102. Je oranžno barvilo, ki se uporablja npr. za barvanje pomarančnega soka, pa tudi za barvanje raznih farmacevtskih preparatov. Tartrazin naj bi povzročal pri otrocih hiperkinetično vedenje, urtikarijo in kožne izpuščaje ter raskavo kožo. Hiperkinetično vedenje pri otrocih sicer težko ločimo od njihovega normalnega vedenja. Ena od možnosti je primerjava z dovolj veliko skupino otrok, ki uživajo hrano brez aditivov, vendar tudi taki poskusi niso dali jasnega odgovora o škodljivosti tartrazina. Po drugi strani je pojav urtikarij nedvomno povezan z uživanjem tartrazina, pa tudi izbruhi astme naj bi bili povezani s tem barvilom. Tartrazine razgrajuje črevesna flora, kar vodi k nastanku številnih metabolitov. Urin živali, ki so jih hranili s tartrazinom, vsebuje tudi nekatere mutagene snovi.

Saharin

            Umetno sladilo saharin so začeli uporabljati že v 19. stoletju. Saharin ima zelo nizko akutno toksičnost (med 5-17.7 g/kg) za poskusne živali. V organizmu se ne metabolizira, pri prostovoljcih, ki so ga uživali daljše obdobje niso zasledili znakov kronične zastrupitve. Dve raziskavi sta nakazali možnost, da bi bil saharin kancerogena snov, a so kasneje ti raziskavi ovrgli. Ko se je izkazalo, da je drugo umetno sladilo (ciklamat) kancerogeno, so raziskave o škodljivosti saharina nadaljevali. Saharin v kombinaciji s ciklamatom v dozah do 2500 mg/kg povzroča raka na sečnem mehurju. Iz prodaje so najprej vzeli ciklamat, kasneje pa je obsežna kanadska raziskava dokazala, da v poskusnih živalih tumorje povzroča tudi saharin. Leta 1977 so tako v Kanadi in ZDA saharin prepovedali. Ker je bil saharin v tistem času edino umetno sladilo, je javnost sprožila vik in krik proti njegovi prepovedi, zato so prepoved začasno preklicali in opravili nove raziskave, ki pa so bile spet nejasne. Predvsem niso mogli dokazati metabolno usodo saharina v organizmu. Subkronična izpostavljenost saharinu ni pokazala mutagenosti pa tudi ne tega, da bi deloval kot elektrofilni kancerogen. Končno so ugotovili, da prehrana, ki je vsebovala do 5% saharina ni povzročala nobenih sprememb pri poskusnih živalih. Če pa so dozo povišali do 7.5% se je pojavnost tumorjev na mehurju močno povečala. Kopičenje saharina v tkivih poskusnih živali pa je drugačna kot pri človeku, zato je varne doze težko prilagoditi človeški uporabi tega sladila. Saharin so danes nadomestila številna druga umetna sladila, ki so verjetno bolj varna.

 

Strupene snovi, ki onesnažujejo okolje (ekotoksične snovi)

            Človeška dejavnost od poljedelstva do industrije in prometa onesnažuje okolje s polutanti. Izpušni plini onesnažujejo zrak in uničujejo ozonsko plast, industrijske in gospodinjske odplake onesnažujejo vodo, razni pesticidi in umetna gnojila onesnažujejo zemljo itd.

Svinec

            Toksične učinke svinca so poznali že 300 let pr. n.š., saj je zastrupitev s svincem opisal že Hipokrat. Delavci v rudnikih in topilnicah svinca so neposredno izpostavljeni svincu. Nekateri zgodovinarji menijo, da je bil svinec kriv tudi za propad rimskega imperija, saj so v kosteh številnih Rimljanov našli velike količine svinca. Danes so glavni vir svinca izpušni plini, nekateri industrijski postopki, odpadni akumulatorji, barve in nekateri insekticidi. Svinec pride v telo s hrano, čeprav je absorbcija skozi črevo dokaj slaba, zato je bolj pomemben tisti svinec, ki pride v telo preko pljuč. Otroci so bistveno bolj občutljivi na svinec kot odrasli. V avtomobilskih izpušnih plinih, ki nastajajo ob izgorevanju osvinčenega bencina (svinčev tetraetil), je svinec. Ti se nato nalaga v zemlji in tako prehaja v žive organizme.

            Svinec najpogosteje prizadene otroke, ki so kot že rečeno, bolj občutljivi. Izpostavljenost povečanim količinam svinca lahko vodi k mentalni zaostalosti, spazmom in cerebralni paralizi, ki lahko traja celo življenje. Svinec torej vpliva na živčevje. Po absorbciji gre najprej v kri, kjer se ga kar 97% nakopiči v eritrocitih. Razpolovna doba v eritrocitih je 2-3 tedne. Nekaj svinca se razporedi tudi v jetra in ledvice, nekaj pa se ga z žolčem odstrani iz telesa, ali pa se naloži v kostno tkivo. "Normalne" količine svinca v krvi so med 0.15 in 0.7 m g/ml, medtem ko so večje vrednosti že toksične. Encefalopatija se pojavi pri konc. med 1-2 m g/ml. Biokemične (metabolne) spremembe pa se odrazijo že pri veliko manjših koncentracijah. Svinec vpliva na aktivnost nekaterih encimov, ki so udeleženi pri sintezi porfirinov, vpliva pa verjetno tudi na sintezo mioglobina in citokroma P-450. Motnje v sintezi porfirinov se odražajo v zmanjšani količini hemoglobina, namesto tega pa se v urinu dvigne nivo koproporfirina in aminolevulične kisline (ALA). To je posledica povečane količine prostega eritrocitnega protoporfirina, kar inhibira ALA dehidrazo. Ta encim je izredno občutljiv na povečane količine svinca. Pri konc. svinca 0.4 m g/ml je ALAD 50% inhibitana, med 0.6 n 0.8 m g/ml se že pojavijo nekateri simptomi zastrupitve, saj je encim že bolj inhibiran, pri 1-2 m g/ml pa se pojavijo klinični znaki encefalopatije. Začetni znaki so bolečine v trebuhu, zaprtost, utrujenost in otopelost. Sledi anemia in učinki, ki so povezani z delovanjem svinca na centralni živčni sistem. Svinec je metabolni inhibitor vsaj treh procesov v sintezi hema. Deluje na encime ferokelatazo, aminolevulonat sintetazo in že omenjeno ALA dehidrazo. Vpleten je tudi v transport železa v mitohondrij.

Pri kronični izpostavljenosti svincu nastajajo pri otrocih tudi motnje in spremembe v rasti kosti. Akutna izpostavljenost lahko vodi tudi k poškodbi ledvic, kronična izpostavljenost pa k nefritisu v tankem črevesju. Vse te spremembe so posledica delovanje anorganskega svinca, zdi pa se, da je organski svinec veliko nevarnejši strup. Svinčev trietil, ki prav tako nastaja ob izgorevanju osvinčenih goriv, se z lahkoto absorbira preko kože. Ker v nasprotju z anorganskim svincem z lahkoto prehaja preko krvno-encefalne bariere, se kopiči direktno v možganih. V rafinerijah je tako prihajalo do akutnih zastrupitev, ki so se odražale z halucinacijami, nenavadnim vedenjem in tesnobo.

Zaradi toksičnosti in ekološke problematičnosti, se proizvodnja osvinčenega bencina danes zamenjujejo z neosvinčenim bencinom, za kar pa morajo bencinski avtomobilski motorji imeti poseben katalizator.

 

Živo srebro in metilHg

Živo srebro je najbolj vročekrven in hladnokrven ljubimec, pravi zdravnik in zloben morilec, dragoceno zdravilo in smrtonosen strup, prijatelj, ki laska in laže.

                                                                                                J. Woodal (1639)

            Nedvomno je živo srebro tako kot svinec močno toksična kovina, katere toksični učinki so poznani vsaj nekaj stoletij. Živo srebro obstaja v treh oblikah: kot elementarno živo srebro in kot živo srebro v anorganskih ali organskih spojinah. Vse tri oblike so strupene. Elementarni Hg (npr. v termometrih) je močno hlapen tudi pri sobni temp. in vdre v organizem z vdihavanjem hlapov. Akutna zastrupitev poškoduje centralni živčni sistem. Anorgansko živo srebro (Hg+ in Hg2+) ni zelo topno, če pa pride v organizem, poškoduje predvsem ledvice. Organske živosrebrne spojine (R-Hg+) se zlahka absorbirajo in so zato bolj nevarne kot anorganske živosrebrove soli. Tudi organske spojine prizadenejo predvsem živčevje. Vse oblike Hg delujejo podobno, saj se vežejo na beljakovine s -SH skupinami. Ker so -SH skupine integralni del številnih encimov, bodo živosrebrove spojine delovale kot inhibitorji teh encimov. Razlike v toksičnosti izhajajo zato bolj iz razlik v distribuciji Hg v organizmu. Elementarno Hg pride v organizem preko pljuč nato pa se v eritrocitih oksidira v Hg2+. Elementarno živo srebro z lahkoto prehaja krvno-encefalno in placentalno bariero zato poškoduje možgane in fetus in se prav tako oksidira v Hg2+. V tej obliki pa ne more nazaj preko barier.

            Anorgansko živo srebro ne more prek barier, pač pa potuje v ledvice, kjer povzroči poškodbe. Organske živosrebrne spojine večinoma prehajajo preko barier in se zato kopičijo v centralnem živčnem sistemu, kjer se prav tako oksidirajo v Hg2+.

Čeprav je zastrupitev z različnimi oblikami Hg v večini primerov posledica poklicne izpostavljenosti, pa je živosrebro znano tudi kot strup, ki se nalaga v okolju. Organski fungicidi na osnovi Hg, uporaba Hg v nekaterih industrijskih postopkih (plastika, papir, baterije) so povzročili, da se je z odpadnimi vodami živo srebro kopičilo v določenih območjih rek, jezer in morij. Najbolj znana zastrupitev z živim srebrom, ki se je kopičil v prehranjevalni verigi, se je dogodila na Japonskem v zalivu Minimata v 50. letih. Tamkajšna tovarna je proizvajala vinilklorid in acetaldehid. Kot katalizator so uporabljali HgCl2. Odpadne vode so iz tovarne odtekale neprečiščene v zaliv Minimata. Po letu dni se je pri okolišnjih ribičih pojavila nova in neznana bolezen, ki so jo kasneje poimenovali sindrom Minimata. Podobna bolezen se je pojavila tudi pri mačkah in psih. Leta 1959 so bolezen povezali z Hg in kopičenjem le tega v ribah, ki jih je jedlo lokalno prebivalstvo in domače živali. V zalivskih usedlinah so našli velike količine metilnega živega srebra. Ker je ta spojina organska in topna v lipidih, se je kopičila v prehranjevalni verigi. Mikroorganizmi so v anaerobnih razmerah (na dnu zaliva) biotransformirali anorganski Hg, ki je veljal za inertnega, v metilno organsko obliko, ta pa je vstopila v prehranjevalno verigo. Bolezen minimata je prizadela okrog 700 ljudi, več kot 10% zastrupljenih pa je umrlo.

Simptomi povezani z delovanjem organskih živosrebrovih spojin na centralno živčevje so: izguba spomina, omrtvelost, tesnoba, zoženje vidnega polja, napredujoča izguba mišične koordinacije, čustvena labilnost in cerebralna paraliza. Slednja je bila najbolj očiten simptom pri otrocih in zlasti pri novorojenih otrocih v primeru sindroma Minimata, ki so bili izpostavljeni že "in utero". Ker pri materah ni bilo opaznih simptomov, je torej v tem primeru metil-Hg odigral vlogo klasičnega teratogena. Metil-Hg zlahka preide placentalno bariero, se koncentrira v možganih zarodka, kjer povzroči nepopravljive poškodbe. V možganih se metil-Hg demetilira, anorganski Hg pa se veže na -SH skupine nekaterih proteinov, kar povzroči metabolne motnje.

 

Testiranje toksičnosti in ocenitev stopnje tveganja

            V večini razvitih držav je preiskus toksičnosti zdravil, prehrambenih aditivov, industrijskih kemikalij in pesticidov obvezen preden pridejo taki proizvodi na trg in v uporabo. Obseg preiskusa toksičnosti je odvisen od same snovi kot tudi od zakonodaje in predpisov, ki veljajo v posamezni državi. Najbolj strogi kontroli so podvržena zdravila, pa tudi pesticidi, nekoliko manj pa industrijske kemikalije, ki se proizvajajo v razmeroma majhnih količinah in imajo ozek krog uporabnikov. Ne glede na vrsto snovi pa vsi preiskusi toksičnosti temeljijo na enakem principu. Preiskus toksičnosti po navadi naredimo na izbrani poskusni živali ali rastlini v izbranih razmerah in pod kontroliranimi pogoji. Pomembne toksikološke informacije pa lahko dobimo tudi z opazovanjem živali ali ljudi med kliničnimi poskusi, pri ljudeh, ki so bili določeni snovi izpostavljeni na delovnem mestu ali v njihovem vsakdanjem okolju.

            Spremljanje izpostavljenosti lahko ugotavljamo tudi z meritvami same snovi ali njenih metabolitov v telesnih tekočinah, pri čemer primerjamo biokemične izvide in patološke spremembe, ki so posledica spremenjenega metabolizma izpostavljenega posameznika.

            V humani pa tudi veterinarski medicini je nujno poročanje o morebitnih stranskih in kontraindikatornih učinkih nekega zdravila. Taka poročila in opažanja se nato vnašajo v toksikološke baze podatkov.

            Za pesticide in podobne kemikalije, ki jih vnašamo v okolje, moramo ugotoviti kakšna je njihova karenca ter kakšno je njihovo morebitno kopičenje v prehranjevalnih verigah. Ekotoksikološke raziskave so zato bistveno bolj obsežne in zapletene kot raziskave na drugih toksikoloških področjih.

            Toksičnost neke snovi je lahko lastna sami molekuli, kar pomeni da je njena biološka aktivnost direktna in da sama vpliva na nek biološki proces, ali pa je toksičnost povezana z njeno biotransformacijo in so toksični le metaboliti uporabljene snovi. Poznavanje fizikalno-kemičnih lastnosti toksične molekule nam lahko da vpogled v njeno delovanje. Odnos med strukturo in funkcijo je v toksikologiji in farmakologiji zelo pomemben zlasti za poznavanje mehanizmov, ki vodijo v kancerogene in mutagene procese. Fizikalno-kemične lastnosti neke molekule odrejajo tudi načine preiskusa toksičnosti. Tako moramo neko potencialno toksično in lahko hlapno industrijsko kemikaljo moramo vsekakor testirati na vnos preko dihal in kože.

Pri preiskusu toksičnosti neke snovi si moramo odgovoriti na sledeča vprašanja:

1. je preiskušana snov nova, ali je že bila v uporabi

2. bo njena uporaba taka, da se bo kopičila v okolju

3. ali se bo uporabljala kot aditiv za človeško prehrano

4. ali se bo uporabljala le v enkratni dozi ali večkrat

5. kakšna naj bi bila uporabljena doza

6. kateri starostni skupini bo namenjena

7. se bo uporabljala za nosečnice

Poleg fizikalno-kemijskih lastnosti neke snovi, moramo pri preiskusu toksičnosti upoštevati tudi biološke dejavnike, ki so pomembni pri izbiri poskusnega organizma:

1. kateri organizem je najprimernejši za preiskus toksičnosti

2. spol poskusnih živali

3. laboratorijski ali divji tip živali

4. namestitev poskusne živali

5. prehrana

6. splošno zdravstveno stanje

7. metabolična podobnost človeku

8. način vnosa

9. trajanje preiskusa toksičnosti

10. število poskusnih živali

11. sredstvo za vnos preiskušane snovi

Ločimo:

-akutni preiskus toksičnosti

-subkronični preiskus toksičnosti

-kronični preiskus toksičnosti

Začetni preiskus toksičnosti je navadno namenjen določitvi približnega območja toksičnih doz. Ko določimo približno toksično dozo, se lotimo bolj zahtevnih in poglobljenih raziskav, ki navadno vključujejo različne preiskuse toksičnosti kot so:

- akutni preiskus

- subakutni preiskus (1-3 mesece)

- kronični preiskus (celo življenje poskusne živali)

- mutagenost

- kancerogenost

- teratogenost

- vpliv na fertilnost

- testi in vitro

- alergenost

- ekotoksičnost itd.

            Medtem ko se zdravila v glavnem preiskušajo na sesalcih, pa se potencialno ekotoksične snovi preiskušajo predvsem na nevretenčarjih kot so vodne bolhe, deževniki, ter na vodnih vretenčarjih kot so ribe in dvoživke, pa tudi na rastlinah zlasti na fitoplanktonu in nekaterih višjih rastlinah.

 

Akutni test

            Akutni testi so tisti preiskusi, ki pokažejo učinke neke snovi v zelo kratkem času. Uporabljajo se za določanje LD50 oz. za ugotovitev razmerja med dozo in odgovorom. Ti preiskusi so podvrženi strogim predpisom in etičnemu kodeksu, ki opredeluje ravnanje s poskusnimi živalmi. Navadno moramo uporabiti vsaj štiri doze, ki jih logaritmsko povečujemo. Določanje LD50 se v novejšem času opušča, čeprav to metodo številni predpisi še vedno zapovedujejo. Zaradi velikega števila poskusnih živali, ki jih potrebujemo za akutne teste, skušamo klasično določanje LD50 nadomestiti z metodami, za katere je potrebno žrtvovati manj poskusnih živali, pa tudi z nekaterimi metodami in vitro, ki pa nam klasičnega pristopa ne morejo popolnoma nadomestiti. Po končanih testih, poskusne živali žrtvujemo in naredimo obdukcijo.

 

Subakutni testi

            Pri subakutnih (subkrončnih) testih opazujemo poskusne organizme dalj časa (po navadi od 28-90 dni), pri čemer so poskusne živali dnevno izpostavljene preiskušani snovi. Ti testi nam dajo odgovor na vprašanje kje se preiskušana snov kopiči oz. kateri so tisti organi, ki so najbolj prizadeti. Podatki, ki jih dobimo s subkroničnimi testi nam pomagajo pri izbiri pravilnih kroničnih preiskusov.

 

Kronični testi

            Kronični poskusi na poskusnih organizmih trajajo skozi celotno življensko obdobje poskusne živali. Sestavljeni so iz opazovanj, meritev metabolitov in obdukcije po smrti poskusne živali. Kronični testi nam dajo vpogled v dolgoročne učinke, ki jih imajo preiskušane snovi, zlasti v njihovo mutagenost in kancerogenost.

 

Stopnja tveganja

            Samo v ZDA proizvajajo okrog 65.000 kemikalj, letno pa temu seznamu dodajo še kakšnih 500 - 1000 novih. V preteklosti so številne kemikalije uporabljali brez pravega nadzora, zato je večkrat prihajalo do škodljivih in tudi tragičnih posledic. Zaradi osveščenega javnega mnenja so danes zakonodaja in predpisi o uporabi novih kemikalij bistveno strožji, zato je strah pred novimi spojinami navadno odveč. Kljub temu pa vedno obstaja določeno tveganje, ki pa ga moramo na osnovi toksikoloških podatkov kritično ovrednotiti. Z drugimi besedami, potencialne nevarnosti uporabe se moramo zavedati in nato presoditi kakšna je stopnja tveganja v primerjavi s koristjo uporabe nove snovi. Tveganje je pravzaprav merilo verjetnosti, da se bodo ob uporabi neke snovi pokazali stranski, negativni učinki. Za neko snov, ki smo jo opredelili kot strupeno in potencialno nevarno, pomeni tveganje njene uporabe pričakovano frekvenco nezaželenih in škodljivih učinkov, ki nastanejo ob izpostavljenosti. Stopnja tveganja ob izpostavljenosti določeni snovi je za vsako snov odvisna od njene toksičnosti, pogostosti in jakosti. To pa je navadno odvisno tudi od posebnih okoliščin, v katerih pride do stika s toksično snovjo. Tveganje torej obsega pravilno identifikacijo toksične snovi, ugotovitev obsega izpostavljenosti, frekvence izpostavitve in trajanja stika s strupeno snovjo. Poleg tega pa moramo dobro poznati učinke in vivo ter razmerje med dozo in odgovorom.

            Nove in vedno bolj izpopolnjene analitske tehnike nam omogočajo detekcijo zelo nizkih koncentracij snovi v okolju, v živih organizmih pa je to mnogo težje in manj natančno. Akutne toksične učinke neke snovi je razmeroma lahko predvideti, veliko težje pa je predvideti kronične učinke, kot sta mutagenost in kancerogenost. Teoretično je sicer mogoče, da ena sama molekula, če prizadene pravo mesto na DNA povzroči usodno mutacijo in/ali pojav rakastega obolenja, vendar je zato malo možnosti in mora obstajati nek koncentracijski prag, ki sproži tak odziv. Določitev ustreznega praga je izredno težavna, za saharin naj bi bil ta prag vsakodnevna doza 120 mg. Taka doza naj bi v populaciji ZDA po 70 letih vodila k nastanku raka na mehurju pri 0.22 do 1.14 x 106 ljudeh. V primeru saharina je torej tveganje zelo majhno, pa vendar je v ZDA saharin prepovedan (t.i Delaneyev amandma, ki prepoveduje uporabo katerega koli prehrambenega aditiva, če ta v še tako majhnih dozah povzroča raka pri poskusnih živalih ali pri človeku). Čeprav se večina toksikoloških raziskav opravlja v sicer dobro opremljenih laboratorijih v skrbno nadzorovanih razmerah, pa je ekstrapolacija teh raziskav v "resnično življenje" v najboljšem primeru po navadi le verjeten približek dejanskemu stanju. Zaradi tega je ocena stopnje tveganja navadno precenjena, s čimer se zavarujemo pred morebitnimi škodljivimi posledicami. Zavedati se moramo, da kar okrog 70% znanih spojin nikoli ne gre skozi vse toksikološke raziskave in da velik del znanja o njihovih učinkih izhaja iz epidemioloških podatkov, ki so posledica dolgotrajne uporabe neke snovi v človeški populaciji.

 

Strupi naravnega izvora (toksini)

            Če smo ljudje v zelo kratkem času razvili številne strupene snovi, pa je evolucija za to potrebovala dalj časa. Nekateri organizmi so tako postali strupeni, svoje strupe pa uporabljajo pri tekmovanju za prostor, za obrambo in za omrtvičenje ali obvladovanje plena.

            Za človeka toksini niso pomembni le kot snovi, ki pod določenimi pogoji povzročijo zastrupitev ali celo smrt, pač pa tudi kot zdravila, snovi za pripravo ustreznih cepiv in predvsem kot neprecenljiva orodja, ki nam pomagajo pri odkrivanju in razumevanju določenih metabolnih procesov. Toksine lahko delimo glede na izvor, bolje pa je če jih razdelimo glede na učinke in mehanizme delovanja. Glede na izvor jih delimo na:

a) mikrobni toksini

- strupi bakterij (endo- in ekso- toksini)

- strupi cianobakterij

- strupi gliv (mikotoksini)

- strupi dinoflagelatnih alg

- strupi drugih alg

b) fitotoksini - strupi, ki so lastni rastlinam

- fitotoksini, ki so strupeni, če jih zaužijemo (alkaloidi, glikozidi)

- fitotoksini, ki povzročajo učinke ob stiku s kožo ali sluznicami

- fitotoksini, ki povzročajo fotosenzibilizacijo

- fitotoksini, ki se širijo preko zraka in povzročajo alergije

c) zootoksini - strupi, ki so proizvod živali in jih delimo na:

- kriptotoksini (strupi, ki pridejo v organizem z zaužitjem določenega dela ali cele           kriptotoksične živali)

- krinotoksini (strupi, ki pridejo v organizem preko kože ali sluznice in so navadno proizvod strupenih kožnih žlez krinotoksičnih živali)

- fanerotoksini (strupi, ki pridejo v telo z aktivnim vnosom preko razvitega         strupnega aparata, povezanega s strupnimi žlezami fanerotoksičnih živali)

Nomenklatura (poimenovanje posameznih strupov) je v toksinologiji nedosledna in zato večkrat pomešana in nepregledna). Tako je npr. delitev bakterijskih toksinov zapletena, predpone ekso- in endo- imata bolj zgodovinske razloge kot pa dejanske. Endotoksini naj bi bili le v notranjosti bakterijske celice, eksotoksine pa naj bi bakterije izločale v okolico, čeprav temu večkrat ni tako. Proteinske bakterijske toksine pogosto imenujemo eksotoksine in so v glavnem proizvod Gram + bakterij, ne pa vedno. Večina eksotoksinov nima nebeljakovinskih komponent in ima močne antigenske lastnosti. Na splošno so bolj toksični kot endotoksini, vendar jih lažje nevtraliziramo.

Toksini delujejo na zelo različne načine, v grobem pa jih delimo na:

citolizini

a) porini

- bakterijski citolizini (a -toksin iz Staphylococcus aureus)

- actinoporini iz morskih veternic (ekvinatoksin II iz Actinia equina)

- citolizini iz meduz (physalia toksin iz portugalske ladjice)

- citolizini iz kožokrilcev (melitin iz čebele Apis melifera)

- palitoksin (iz zoantarija Palythoa toxica)

- citolitični antibiotiki (gramicidin)

- pardaxin (iz morskega lista, Pardarchirus marmoreus)

b) citolitični encimi

- fosfolipaze, A, C in D

c) detergenti

- citolizini iz bazidomicet

- saponini (v glavnem rastline)

- pirmezin

Toksične fosfolipaze

- bakterijske fosfolipaze

- kačje fosfolipaze

- fosfolipaze kožokrilcev

- fosfolipaze morskih vetrnic

Toksični proteini, ki inhibirajo proteinsko sintezo

a) iz rastlin

- ricin in abrin

b) iz bakterij

- toksin davice (Diphteria)

- Shigella citotoksin

c) iz gliv

- sarcin

Genotoksini

- afla toksini

- okratoxin

- patulin

- razni antibiotiki

- okadaična kislina

Nevrotoksini (toksini, ki delujejo na ionske kanalčke in procese v sinapsah)

a) blokatorji Na+, K+ in Ca++ kanalčkov)

- peptidi iz morskih vetrnic

- škorpionski toksini (karibdotoksin)

- TTX (tetrodotoksin), STX (saksitoksin)

b) blokatorji nikotinskih in muskarinskih receptorjev (postsinaptični toksini)

- številni kačji strupi (a -bungarotoksin)

- toksini iz dvoživk (batrahotoksin)

c) inhibitorji acetilholinesteraze

- fascikulin

Toksini, ki vplivajo na strjevanje krvi, delujejo hemoragično in lokalno

zlasti številni kačji toksini:

- hemoragini

- dermonekrotični faktorji

- miotoksini

- disintegrini

- prokoagulanti

- aktivatorji komplementa

Bakterijski enterotoksini

- kolera toksin

- enterobakterijski toksini (Echerichia, Yersinia, Campylobacter)

Bakterijski endotoksini

- številni toksini mikroorganizmov

Toksini, ki delujejo na citoskelet

a) toksini, ki delujejo na mikrotubularni sistem

- številni rastlinski alkaloidi (npr. kolhicin, vinca alkaloidi)

b)toksini, ki delujejo na mikrofilamente

- falotoksini (stabilizirajo mikrofilamente)

c) citohalasini

d) bakterijski proteinski toksini (npr. Clostridium difficile in drugi klostridijski toksini)

e) toksini cianobakterij

- mikrocistini

Toksini, ki imajo drugačno biološko aktivnost od naštetih

- sarafotoksini

- spalni toksin

- kalikreini/kininogenaze

 

Citolizini

            Citolizini so zelo heterogena skupina snovi, ki so široko razširjeni med strupenimi organizmi. Ne glede na strukturno različnost in razlike v mehanizmu delovanja, jim je skupno to, da poškodujejo celično membrano, porušijo nadzor nad prehajanjem snovi in povzročijo smrt celice.

            Vse celice imajo plazmatsko membrano, ki celično notranjost razmejuje od zunanjosti. Ker membrane različnih celic niso enake, so tudi različno občutljive na delovanje citolizinov. Poleg tega so membrane nekaterih celic bistveno težje dostopne za večino citolizinov, kar zlasti velja za rastlinske in bakterijske celice, ki imajo celično steno. Zaradi velike raznolikosti membran različnih celic, ki jih sicer v principu sestavljajo isti gradbeni elementi, a v različnih razmerjih in različno porazdelitvijo, ni presenetljivo, da so tudi citolizini zelo heterogena skupina toksinov.

            Citolizini so proizvod številnih organizmov. Tako jih najdemo pri bakterijah, glivah, rastlinah, ožigalkarjih, žuželkah, ribah in kačah. Čeprav so mehanizmi delovanja številnih pomembnih citolizinov še vedno dokaj nepojasnjeni, jih kljub temu v grobem delimo na:

- citolizine, ki naredijo transmembranske kanalčke ali pore (porini)

- citolizine z encimskim delovanjem (fosfolipaze)

- citolizine z detergentskim delovanjem

- citolizine z nepojasnjenim mehanizmom delovanja

Porini

            Kljub temu, da vsi porini tvorijo transmembranske pore, obstaja veliko načinov, ki privedejo do nastanka por. Premer por je 15 nm pri tiolno aktiviranih bakterijskih porinih, 2-3 nm pri stafilokoknemu a -toksinu, 0.5-1 nm pri aktinoporinih iz morskih veternic in le 0.2 nm pri antibiotiku gramicidinu. Nastanek por poruši normalno permeabilnost celične membrane, poruši se elektrolitsko ravnotežje, Na+ ioni vdro v celico, posledica je vdor vode, celica se napihne in poči. Liza celice je torej posledica koloidno-osmotskega tipa citolize.

            Med citolizini, ki v membrani naredijo pore, so dokaj dobro raziskani bakterijski tiolno aktivirani citolizini. Ti toksini se aktivirajo s šibko redukcijo inaktivirajo pa s šibko oksidacijo. Za njihovo vezavo je očitno potrebna prosta -SH skupina. Membranski receptor je holesterol, ki je verjetno potreben za agregacijo posameznih toksinskih molekul v membrani, kar vodi k nastanku pore. Četudi se zdi, da je mehanizem delovanja teh toksinov enak, pa med njimi obstajajo kar precejšnje biokemične razlike. Čeprav so po vezavi tiolno aktiviranih citolizinov v membranah prizadetih celic lepo vidne krožne ali polkrožne strukture toksinskih molekul, pa ni jasno, kako toksinski oligomeri prehajajo preko membrane. Značilen predstavnik te skupine toksinov je streptolizin O iz bakterije Streptococcus pyogenes. Edini podoben toksin nebakterijskega izvora je metridiolizin, ki so ga izolirali iz morske vetrnice Metridium senile.

            Nekoliko manjše pore, ki so ravno tako posledica nastanka toksinskih oligomerov v membrani najdemo v primeru stafilokoknega a -toksina iz bakterije Staphylococcus aureus, ki pa očitno nima specifičnega membranskega akceptorja. Tudi melitin iz čebeljega strupa se kot oligomer zlahka vrine v membrano. Citolizini iz morskih vetrnic (aktinoporini) pa se verjetno vežejo na sfingomielin in nato tvorijo oligomerne transmembranske pore. Zelo majhne pore inducirajo citolitični antibiotiki, kot npr. gramicidin iz bakterije Bacillus brevis. Transmembranska pora nastane med dvema molekulama gramicidina.

Fosfolipaze

            Fosfolipaze so encimi, ki povzročijo direktno ali indirektno lizo celice. Hidrolizirajo membranske lipide in tako naredijo membrano bolj občutljvo za delovanje nekaterih drugih komponent strupa. Le nekatere fosfolipaze so direktno litične. Nekatere snovi aktivirajo tudi endogene fosfolipaze A in C, ki so sicer normalne sestavine številnih celičnih membran, kar privede k aktivaciji samouničevalnega mehanizma. Fosfolipaze A2 so pogosta sestavina številnih kačjih, škorpionskih, čebeljih in osjih strupov, vendar njihovo delovanje ni primarno citolitično, pač pa nevrotoksično ali miotoksično. Citolitično največkrat delujejo v kombinaciji z drugimi komponentami strupa, kot je npr. čebelji melitin ali kardiotoksin iz kobre. Že omenjena bakterija S. aureus vsebuje fosfolipazo C (sfingomielinazo), ki hidrolizira membranski sfingomielin, bakterija Corynebacterium pseudotuberculosis pa vsebuje fosfolipazo D, ki tudi deluje na sfingomielin poleg tega pa tudi na lizolecitin.

Citolizini, ki delujejo kot detergenti

            Snovi, ki znižujejo površinsko napetost membrane, imenujemo surfaktanti ali detergenti. Če so dovolj močni bodo povzročili porušitev strukture celične membrane in lizo celice. Take snovi so zlasti pogoste pri rastlinah, najbolj značilen primer so saponini. Najdemo jih tudi v nekaterih spužvah, žabah in morskih vetrnicah. Saponini so glikozidi, ki so sestavljeni iz nesladkornega dela (steroid ali triterpenoid) in sladkornega dela. Večina saponinov ima detergentske lastnosti, čeprav lahko naredijo t.i. alfalfa saponini v membrani tudi majhne pore.

Citolizini z nepopolno pojasnjenim delovanjem

V to skupino uvrščamo toksine, katerih delovanje kljub obsežnim raziskavam ni popolnoma pojasnjeno. Najbolj značilen primer so kardiotoksini (citotoksini, direktni litični faktorji) iz strupa kobre, katerih citolitično delovanje je šibko, se pa močno poveča ob dodatku majhnih količin fosfolipaze A2.

Nekaj primerov citolizinov:

Streptolizin O

            Streptolizin O je toksičen, imunogen protein, ki ga v medij izločajo patogene bakterije rodu Streptococcus. Toksični sevi teh bakterij povzročajo lizo celic. Streptolizin O se imenuje tako zato, ker ga lahko inaktiviramo z oksidacijo, reaktiviramo pa z redukcijo, kar je sicer značilnost bakterijskih tiolno aktiviranih citolizinov. Izolacija streptolizina O je težavna, saj protein rad denaturira. Najlaže ga izoliramo s pomočjo imunoafinitetne kromatografije. Je protein velik 67.000 Da z It 7.8. Natančna aminokislinska sestava ni poznana.

            Streptolizin O je citolitičen za večino, če ne za vse evkariotske celice. Za aktivnost toksina je potrebna vsaj ena prosta -SH skupina, toksin pa lahko inhibiramo z dodatkom holesterola. Streptolizin O se veže v membrane, kjer ga s pomočjo elektronske mikroskopije zlahka prepoznamo, saj tvori značilne polkrožne loke (najpogosteje v obliki črke "C"). Predpostavljamo, da je membranski akceptor za toksin holesterol, pri vezavi pa naj bi ključno vlogo odigrale proste -SH skupine.

            Začetna vezava toksina v membrano je zelo hitra in temperaturno neodvisna. Hitrost lize pa je temperaturno odvisna, saj zvišanje temperature hitrost poveča, kar je povezano s spremenjeno fluidnostjo membrane. Večja ko je fluidnost, lažje toksinske molekule oligomerizirajo. Strukture, ki so vidne v membrani z elektronskim mikroskopom naj bi predstavljale tudi pore. Le-te naj bi bile obdane s posameznimi toksinskimi molekulami pa tudi z membranskimi lipidi. Premer por je velik (15 nm), kar tudi večjim molekulam omogoča hitro difuzijo iz celice. Število molekul, ki naj bi formirale posamezno poro je med 70 in 80. V principu zadostuje ena sama pora, da eritrocit lizira. Za isti učinek bi bilo potrebnih kar 106 detergentskih molekul, kar govori o izjemni jakosti streptolizina O. O delovanju streptolizina O obstaja tudi druga hipoteza, pri kateri naj toksin ne bi induciral nastanek por, pač pa le strukturno spremembo v organizaciji celične membrane, kar naj bi vodilo k lizi celice. Streptolizin O je letalen toksin ki učinkuje zelo hitro. LD50 za miši je 10 m g/kg. Večje doze toksina povzročajo skoraj takojšnjo ustavitev srca. Pri človeku je delovanje streptolizina O verjetno povezano z nekaterimi simptomi pri revmatični mrzlici, glomerulonefritisu in škrlatinki.

            Ker molekularni mehanizmi delovanja streptolizina O niso popolnoma pojasnjeni, se ta toksin le redko uporablja kot eksperimentalno orodje. Uporablja se za porušitev permeabilnostne bariere pri nekaterih žleznih celicah, iz katerih se tako sproste tudi snovi, ki jih normalno te celice ne izločajo. Tako izločimo kontrolne mehanizme, ki jih nadzoruje plazmatska membrana. Streptolizinu sorodni bakterijski toksini so cereolizin iz b. B. cereus, perfringolizin iz C. perfringens ter listeriolizin iz hemolitičnega seva b. Listeria monocytogenes.

Staphylococcus aureus a -toksin

            a -toksin je najbolje poznana molekula med vsemi, ki jih najdemo v tej bakteriji. Verjetno je glavni virulentni dejavnik. Toksin je 33.000 Da velik protein z It 8.5. Poznamo njegovo aminokislinsko zaporedje, ki so jo določili na podlagi nukleotidne sekvence. Polipeptidna veriga je sestavljena iz 320 aminokislin. Toksin lahko obstaja kot monomer, lahko pa sestavlja tudi oligomere s šestimi toksinskimi monomeri. Le monomeri se lahko vežejo na membrane, vendar se znotraj membran nato oblikujejo heksamerne strukture. Čisti toksin je proteolitsko občutljiv, denaturira pa ga tudi zamrzovanje.

Mehanizem delovanja, tako kot pri streptolizinu O, ni popolnoma pojasnjen. Toksin lizira eritrocite, trombocite in levkocite. Ob stiku z membranami pride do vezave toksinskih monomerov, ki kasneje oligomerizirajo v heksamere, ti pa naj bi formirali poro. Občutljivost celic na a -toksin je različna. Tako so zajčji eritrociti kar 100x bolj občutljivi od človeških, zaradi česar predvidevajo, da naj bi za toksin v membranah obstajal specifičen vezavni protein (receptor). Ne glede na to pa je toksin površinsko aktiven, zaradi česar smatrajo, da naj bi razlike v občutljivosti izvirale iz različne sestave lipidnih membran in s tem povezanih razlik v površinski napetosti. Zdi se da se toksinovo vezavno mesto razlikuje od "toksičnega" mesta. To so ugotovili s pomočjo kemijskih modifikacij. Jodiranje enega samega tirozinskega ostanka namreč ne prepreči vezave na zajčje eritrocite, čeprav se toksičnost (litičnost) zmanjša na le 10% nativnega toksina. Raziskave kažejo, da je N-terminalni del molekule odgovoren za toksične lastnosti, C-terminalni del pa za vezavo, kar pa je v zadnjem času postalo sporno. Eden od modelov indukcije transmembranske pore predvideva, da je toksinski monomer sestavljen iz dveh fiksnih delov, ki sta nekje v sredini polipeptidne verige povezana z nekakšnim gibljivim mostičkom. Z CD spektri so ugotovili, da je sekundarna struktura toksina v veliki meri b -struktura in da med monomeri in heksameri v tem ni velikih razlik. Vprašanje (podobno bomo videli tudi pri EqT II) je v tem, da ni jasno kako se relativno hidrofilen protein vrine v membrano, kjer oblikuje stabilne agregate. Predpostavili so, da se ob vezavi toksina na membrano, gibljivi toksinski del odpre in izpostavi dva zakrita hidrofobna dela. Toksin preide v nekakšno obliko amfipatske paličice, ki se lahko vrine v membrano. V membrani pride do oligomerizacije, lumen heksamerne pore pa obdajajo hidrofilni (polarni in nabiti) aminokislinski ostanki. Pore naj bi imele premer med 2 in 3 nm, čeprav nekatere raziskave na pljučnih fibroblastih kažejo, da je premer por manjši od 1 nm. Zaradi majhnega premera por bodo iz celice izhajale le manjše molekule in ioni, kar privede do porušitve normalnega ionskega gradienta, posledica pa bo nastanek koloidno-osmotske lize. Z raziskavami prevodnosti toksinskih por (kanalčkov) v umetnih lipidnih membranah so ugotovili, da je prevodnost posamezne pore okrog 90 pS v 0.1 M KCl in narašča s povečevanjem ionske jakosti. Pore so delno napetostno odvisne in kažejo nekoliko večjo selektivnost za Cl- kot za K+ ione. Divalentni kationi večinoma blokirajo toksinske kanalčke, ne preprečujejo pa vezave toksina na membrane.

            a -toksin povzroča in vivo številne učinke. Pri zajcih povzroča ledvične nekroze in paralizo zadnjih okončin. Navidezna nevrotoksična aktivnost je verjetno posledica demielinizacije živčnih vlaken. V velikih dozah povzroči pogin poskusnih živali po nekaj minutah, glavna značilnost pa je obsežna hemoliza. Subkutane infekcije povzročajo dermonekroze. i.v LD50 za miši je okrog 50 m g/kg. a -toksin se veliko uporablja pri študiju procesov eksocitoze, saj ne vpliva na citoplazmatske encime, pač pa le na propustnost za ione.

Antibiotiki- gramicidin in alameticin

            Gramicidin je linearni polipeptid, ki so ga izolirali iz bakterije Bacillus brevis. Sestavlja ga 15 aminokislin, pri čemer se izmenjujejo d- in l-aminokisline. Poznamo nekaj podtipov gramicidinov, ki so na splošno zelo hidrofobne molekule in se zato z lahkoto vrinejo v celične membrane. Tvorijo nenavadno b -vijačnico (heliks), ki ima polarne aminokisline orientirane v notranjost heliksa, nepolarne pa so na zunanji strani vijačnice. Predvidevajo da poro oblikujeta dve monomerni podenoti gramicidina. Pora, ki je napolnjena z vodo ima premer le 0.2 nm.

Alameticin je antibakterijski polipeptid iz glive Trichoderma viride. Sestavlja ga 20 aminokislin, od katerih jih je kar osem a -aminoizomaslena kislina, torej neobičajna aminokislina, ki jo navadno ne najdemo v polipeptidnih verigah. Alameticin povzroči nastanek napetostno odvisnih por (kanalčkov) v naravnih in umetnih membranah (npr. v Ranvierovih zažetkih). Alameticinski kanalčki se odpro le ob hiperpolarizaciji, poznanih je nekaj različnih odprtih stanj, ki se razlikujejo po prevodnosti. V mediju, ki vsebuje 120 mM konc. soli, je prevodnost posameznega kanalčka 600 pS, kanalček pa je v povprečju odprt okrog 30 msec, pri napetosti -90 mV. Če na notranji strani membrane naraste konc. Ca++ ionov, kanalček ni več prevoden. V nasprotju z gramicidinom je za tvorbo posamezne pore ali kanalčka potrebnih 8 alameticinskih monomerov. Geometrija pore naj bi bila taka, da so C-terminalni konci monomerov povezani, helični deli monomerov pa prosti in lahko rotirajo pod vplivom transmembranskega električnega polja. To pojasnjuje razlike v prevodnosti kanalčka ob spremembi napetostnega potenciala. Razlika napetosti 4 mV povzroči 2.5x spremembo v prevodnosti kanalčka.

Melitin

            Melitin je najbolj znan, ne pa edini predstavnik citolizinov kožokrilcev. Je glavna toksična sestavina strupa domače čebele Apis mellifera in verjetno glavni dejavnik bolečine ob čebeljem piku. Sestavlja do 50% vsega čebeljega strupa. Melitin je polipeptid, ki ga sestavlja 26 aminokislin. Šest aminokislin je pozitivno nabitih, od tega so štiri na C-terminalnem delu molekule. N-terminalni del je hidrofoben. Okrog 10% naravnega melitina (poznamo tudi umetno sintetizirani melitin) ima formiliran N-terminus. Melitin je značilna amfifilna molekula z dominantnim hidrofobnim delom in krajšim, a zelo hidrofilnim C-terminalnim delom. V raztopini najdemo melitin v obliki monomerov ali tetramerov, kar pa je odvisno od ionske jakosti razstopine in od koncentracije samega toksina. Monomer melitina ima obliko upognjene paličice, ki jo sestavljata dva a -heliksa. V tetramerni obliki (kristalna zgradba- trodimenzionalna stuktura določena s kristalografijo) so štiri verige povezane tako, da so nepolarni ostanki obrnjeni v notranjost oligomera, proti vodi pa štrlijo polarne aminokisline. V membranah melitinske molekule verjetno agregirajo ravno obratno, tako da tvorijo poro, katere lumen obdajajo nabite aminokisline, nepolarni, hidrofobni ostanki pa so obrnjeni proti lipidnemu matriksu. Kljub verjetnosti take hipoteze, pa zanjo še ne obstajajo trdni eksperimentalni dokazi.

            Melitin v mikromolarnih količinah povzroča lizo številnih celic, najpogosteje pa se za preučevanje njegovega mehanizma delovanja uporabljajo eritrociti ali umetne membrane. V slednjih melitin inducira napetostno odvisne kanalčke, ki so bolj prevodni za anione kot katione, monovalentni kationi lažje prehajajo skozi poro kot divalentni kationi. Prevodnost posameznih por je očitno zelo različna, saj znaša od 20-2000 pS.

            Izolacija melitina ni zelo preprosta, zato so pripravki melitina večkrat kontaminirani z manjšimi količinami fosfolipaze A2. Ker obe molekuli delujeta sinergistično, je potrebno pred uporabo čistost melitina dobro preveriti, da ne pride do napačne interpretacije rezultatov. Melitin verjetno ne deluje le kot citolizin porinskega tipa, ampak v večjih konc. tudi kot detergent. Obstajajo številni sintetični in rekombinantni melitinski analogi, s pomočjo katerih študirajo zvezo med strukturo in funkcijo te zanimive toksinske molekule. Melitin naj bi bil zanimiv za razvoj novih bioinsekticidov, saj je primerna molekula za metode genetskega inžinirstva.

Citolizini morskih vetrnic

            Citolizine morskih vetrnic so izolirali iz vsaj 20 vrst morskih vetrnic. Te toksine imenujemo tudi aktinoporini. So bazični proteini, veliki okrog 20 kDa, skupno pa jim je tudi to, da jih inhibira sfingomielin. Znane primarne proteinske sekvence so homologne, citolizini ne vsebujejo a.k. cisteina. Aktinoporini lizirajo razne celice, imajo pa tudi druge fiziološke učinke. Smrt poskusnih živali je vedno povezana z obsežno hemolizo in zastojem delovanja srca. Najbolj znani toksini iz družine aktinoporinov so citolizini iz morskih vetrnic Stychodactyla helianthus (Sh III), Actinia tenebrosa (Tn-C) in Actinia equina (EqT II).

Ekvinatoksin II

            EqT II je najbolje raziskan citolizin iz morskih vetrnic. Je značilen predstavnik družine aktinoporinov. Poznamo tudi vsaj dva homologna toksina iz iste vrste morske vetrnice (A. equina), ki imata podobne lastnosti (EqT I in EqT III). EqT II je zelo bazičen polipeptid, ki ga sestavlja 179 aminokislin in ima It 9.8. EqT II naredi kationsko selektivne pore v raznih celicah in umetnih membranah. Pore so sestavljene iz 3-4 molekul toksina in so prevodne tudi za neelektrolite. Premer posamezne pore je okrog 1 nm. Nastanek por in posledično lize prizadete celice naj bi potekal v štirih stopnjah:

- vezava toksinskih monomerov na membrano

- insercija enega ali več hidrofobnih delov v membrano

- oligomerizacija 3-4 toksinskih molekul v membrani

- nastanek pore in liza celice

Vezava toksina, ki v fizioloških razmerah nosi močan pozitivni neto naboj, je verjetno ionska in poteče med pozitivno nabitimi aminokislinskimi ostanki toksina in negativnimi naboji sfingomielina. Ta naj bi deloval kot nekakšen membranski receptor za toksin. To sklepamo na osnovi dejstva, da sfingomielin sicer ni nujno potreben za vezavo toksina na membrano, da pa toksin ne lizira celic, ki sfingomielina ne vsebujejo (npr. bakterijskih sferoplastov). Po vezavi sledi insercija hidrofobnih delov toksina v membrano, vendar še danes ne vemo, kateri so ti deli. Predvidevamo, da je to N-terminalni del molekule, ki ima obliko dvojne vijačnice in je dovolj dolg ter amfipatičen. Ko je toksin vrinjen v membrano, pride zaradi njene fluidnosti do lateralne oligomerizacije posameznih toksinskih molekul, to pa vodi k nastanku transmembranske pore. Pora je kationsko selektivna in ima prevodnost okrog 225 pS. Modifikacija bazičnih aminokislin (lizina) vodi k povečani prevodnosti in večji selektivnosti za katione, modifikacija kislih aminokislin pa k bistveno zmanjšani prevodnosti in izgubi selektivnosti pore. Sklepamo lahko, da je notranjost toksinskih por (kanalčkov) v nativnem stanju močno negativno nabita in torej kationsko selektivna. Molekula EqT II ima nekaj delov, ki so močno hidrofobni, najbolj že omenjeni N-terminalni del. Kljub temu je EqT dobro topen v vodi, zato se lahko vprašamo, kako se spremeni njegova sekundarna zgradba ob stiku z membrano, da mu sprememba konformacije omogoči insercijo v lipidni dvosloj. CD spektri so pokazali, da EqT v nativnem stanju vsebuje od 53-58& strukture b in le okrog 30% a -heliksa. Ob dodatku liposomov pa se odstotek a -heliksa poveča do 75%, odstotek strukture b pa močno upade. Ta sprememba je bila zlasti očitna, če so liposomi vsebovali sfingomielin.

            Ekvinatoksin II kot tudi drugi citolizini morskih vetrnic ne delujejo le litično, pač pa tudi citotoksično, kardiotoksično in letalno. Kot kaže lahko v zelo nizkih koncentracijah inhibirajo v določenih tkivih tudi nekatere ionske kanalčke. Ker za njihovo delovanje ni potrebno, da prodro v celico, so nekatere citolizine skušali uporabiti kot imunotoksine - orodja za boj proti raku. Problem uporabe citolitičnih imunotoksinov je zlasti v imunogenosti samih citolizinov ter njihove aktivacije na sami tarčni celici in vivo. EqT II so konjugirali tudi s transferinom, ki je eden glavnih regulatorjev rasti. Ker so transferinski receptorji prisotni le na malignih celicah, ne pa tudi na normalnih plazemskih celicah, so konjugati med toksinom in transferinom obetavno sredstvo v boju proti transformiranim tumorskim celicam, vendar pa so te raziskave šele v začetni fazi.

Nekateri citolizini iz meduz in cevkašev (sifonofor)

            Ti toksini spadajo med najbolj strupene snovi, ki jih poznamo v morskih organizmih. Nekaj citolizinov meduz in cevkašev je letalnih in so zelo nevarni tudi človeku. Kljub njihovi razvpitosti pa o teh strupih vemo bolj malo, saj je njihova izolacija izredno težavna. Citolizini meduz so v primerjavi z aktinoporini zelo velike in neobstojne molekule občutljive na proteolitski razkroj. Za človeka so nevarni zlasti toksini meduz morske koprive (Chrysaora quinquecirrha), morskih os ali kockastih meduz (Chiropsalmus quadrigatus in Chironex fleckeri) in cevkaša portugalske ladjice (Physalia physalis). Strup morske koprive vsebuje dve komponenti z mol. m. 100.000 in 190.000 Da. Izolirali so ju iz lovilnih lovk, iz obustnih krp pa so osamili tri druge toksine z mol. m. 108.000, 160.000 in 175.000 Da. Vsi toksini lizirajo piščančje miocite, ne pa tudi eritrocitov, kar je vsekakor zanimivo. V umetnih membranah (Chol, PH) ti toksini inducirajo kationsko selektivne kanalčke, ki pa prepuščajo le monovalentne katione.

            Iz morske ose Chironex fleckeri so s pomočjo imunoafinitetne kromatografije delno izolirali 20.000 Da velik protein, ki je liziral v celični kulturi piščančje srčne celice (LD50 za miši okrog 40 m g/kg). V umetnih membranah toksin inducira pore, ki so permeabilne za monovalentne katione, dvovalentni kationi pa jih blokirajo. Izolirali so tudi toksin z mol. m. 50.000 Da, ki je prav tako hemolitičen, kardiotoksičen, dermonekrotičen in je letalna komponenta strupa morskih os. Strup omenjene morske ose je v Avstraliji odgovoren za več smrtnih žrtev kot morski psi. Deluje izredno hitro, včasih žrtev niti ne uspe priti iz vode. Smrtnost je brez uporabe antiseruma velika in nastopi zaradi kardiotoksičnih učinkov.

            Fizalitoksin je citolitičen toksin, ki so ga delno izolirali iz ožigalk cevkaša portugalske ladjice (Physalia physalis). Toksin je velik glikoprotein, ki ga sestavljajo tri glikozilirane podenote. Mol. m. je okrog 240.000 Da. Toksin je močan citolizin, saj deluje v 10-10 M koncentracijah, inhibiramo pa ga lahko z dodatkom concanavalina A.

Palitoksin

            Palitoksin je najmočnejši strup, kar jih premorejo morski organizmi. Izolirali so ga iz zoantarnih koralnjakov rodu Palythoa (P. toxica, P. tuberculosa, P. caribaeorum). Palitoksin ni protein, pač pa strukturno zapletena polietrska spojina z mol. m. 2659 Da. Sestavlja ga dolga, delno nenasičena alifatska veriga in nekaj serij aromatskih obročev. Obstajata še vsaj dve palitoksinski različici, ki pa se od osnovne strukture le malo razlikujeta. Palitoksin lizira eritrocite glodalcev in človeka, eritrociti nekaterih drugih sesalcev pa so razmeroma neobčutljivi (npr. ovčji, goveji, pasji). Potek lize je polnoma drugačen kot pri drugih citolizinih, saj je ta počasen. Hemoliza nastopi šele z značilnim okrog eno urnim zamikom, kljub temu pa so za hemolizo dovolj že subnanomolarne konc. palitoksina. Značilnost hemolize, ki jo inducira palitoksin, je hitro izhajanje K+ iz celice. Ta nastopi takoj, ko se toksin veže na membrano. Na posameznem eritrocitu naj bi bilo okrog 200 vezavnih mest za palitoksin, njegova Kd pa okrog 10-11. Vezavo toksina in hemolizo preprečimo z oubainom in drugimi kardiotoničnimi steroidi, kar kaže na vpletenost Na+K+ ATPaze pri delovanju palitoksina. Kljub temu pa črpalka očitno ni glavno tarčno mesto za palitoksin, saj so potrebne bistveno večje konc. toksina za inhibicijo encima kot za samo lizo. Hipoteza pravi, da predstavlja Na+K+ATPaza vezavno mesto za palitoksin, ki potem poveča prevodnost za K+ ione. Možno je tudi, da bi palitoksin deloval kot ionofor, podobno kot nekateri antibiotiki (gramicidin). Nedavno so dokazali, da v izoliranih miocitih inducira posamezne kanalčke. Ti kanalčki naj bi bili selektivno prevodni za Na+ in druge monovalentne katione, vendar jih tetrodotoksin ne blokira. Že 30 pM koncentracija palitoksina je dovolj za indukcijo kanalčkov, prevodnost posameznega kanalčka pa je zelo majhna, le okrog 9 pS. Palitoksin je letalen strup in ima LD50 med 25-500 ng/kg miši.

            Nekatere novejše raziskave kažejo, da palitoksin ni nujno proizvod ožigalkarjev iz rodu Palythoa saj so ga zasledili tudi v nekaterih vrstah rakov. To kaže na možnost, da je tudi palitoksin, tako kot nekateri drugi toksini (saksitoksin ciguatoksin) proizvod nekaterih alg in se lahko kopiči v prehranjevalnih verigah.

Pardaksini

            Morski listi iz rodu Pardarchirus (P. marmoratus iz Rdečega morja in pacifiška vrsta P. pavoninus) izločata iz žlez toksičen izloček, ki deluje kot močan repelent proti morskim psom. Toksični izločki iz obeh vrst se nekoliko razlikujejo po a.k. sestavi, vsebujejo od 31 (pardaksin II) do 35 a.k. (pardaksin I). Pardaksin I ima molsko maso 3500 Da, pardaksin II pa 3200 Da. Pardaksini so nekoliko podobni melitinu, saj imajo močno hidrofilen C-terminalni del in močno hidrofoben del, ki v vodnih razstopinah rad agregira. Kljub temu pa se pardaksini od melitina precej razlikujejo, saj v njihovi zgradbi prevladujejo kisle amino kisline. Pardaksini lizirajo eritrocite, verjetno z indukcijo neselektivnih por, v večjih konc. pa delujejo kot detergenti. Novejše raziskave kažejo, da pardaksini močno vplivajo na nekatere procese v sinapsah, zlasti tiste, ki so povezani z eksocitozo. Pardaksini stimulirajo vdor kalcija v celico, eksocitozo in sproščanje kateholaminov pa stimulirajo tudi, če kalcija ni. Pomen pardaksinov je zlasti v njihovi neverjetni učinkovitosti proti morskim psom, saj že majhne količine toksinov morskega psa popolnoma odvrnejo od požrešnih nakan.

Citolitični toksini, ki delujejo kot detergenti

Saponini

            Saponini so hemolitični glikozidi, ki jih najdemo v številnih rastlinah in nižjih organizmih. Sestavljeni so iz triterpenoidnega ali steroidnega dela, ki sta pripeta na sladkorno komponento. Saponini delujejo kot detergenti, iz membrane iztrgajo lipidne molekule in membrano poškodujejo tako, da celica lizira.

            Zelo znani saponini so ehinozidi in holoturini, ki jih vsebujejo nekatere morske kumare. Ti saponini lizirajo eritrocite v nM do m M koncentracijah. Rastlinski saponini eritrocitov večinoma ne lizirajo. Saponini niso le litični, pač pa povzročajo tudi pozitivne inotropne in kronotropne učinke na srčni muskulaturi.

Iz že omenjenega morskega lista Pardarchirus marmoratus so izolirali steroidne aminoglikozide - pavonine in mosezine, ki nekoliko spominjajo na saponine in so prav tako litični ter delujejo odbojno na morske pse.

 

Polipeptidi iz bazidiomicetnih gliv

            Detergentsko delovanje imajo tudi številni polipeptidi iz bazidiomicetnih gliv. Ti polipeptidi so temperaturno zelo neobstojni. Veliki so od 12.500 do 50.000 Da. Glede na It se precej razlikujejo, vendar kljub temu vsi delujejo litično. Izolirali so jih iz nekaterih užitnih gliv (rubescenslizin iz mušnice Amanita rubescens, pleurotolizin iz ostrigarja Pleurotus ostreatus, volvatoksin iz Volvariella volvacea in flamutoksin iz glive Flammulina velutipes) ter falolizin iz smrtno strupene zelene mušnice (Amanita phalloides), kjer pa ta toksin nima vloge, saj v prebavnem traktu razpade. Falolizin naj bi po nekaterih domnevah deloval tako, da aktivira endogeno fosfolipazo A2.

Toksini z neznanim mehanizmom citolitičnega delovanja

Kardiotoksini (citotoksini, membranotoksini)

            Strup raznih vrst kober vsebuje številne kardiotoksine, ki zlasti v večjih koncentracijah delujejo direktno na membrane. In vivo povzročajo sistolični blok srca in depolarizacijo srčnih mišičnih celic. Kot že rečeno so v večjih konc. hemolitični. So bazični polipeptidi, ki jih sestavlja 60-63 aminokislin. Veriga je zavita in povezana s štirimi disulfidnimi mostički. Vsi znani kardiotoksini so homologne molekule. Značilnost številnih kardiotoksinov je, da se njihova litičnost močno poveča, če je v pripravku vsaj 1% fosfolipaze. Po zgradbi so zelo podobni kuraremimičnim kačjim toksinom iz elapidnih kač, kar so potrdili tudi s kristalografijo. Kakšen je natančen mehanizem delovanja kardiotoksinov na membrane ni znano. V večjih konc. verjetno delujejo kot detergenti, v manjših pa zgolj depolarizirajo celice, ne da bi bile opazne večje morfološke spremembe. Možno je tudi, da aktivirajo endogene fosfolipaze. Čeprav ne kažejo velike toksičnosti (LD50 okrog 1 mg/kg miši) pa so klinično pomembni, saj se simptomi njihovega delovanja kažejo pri nekaterih ugrizih določenih vrst kober (ugriz afriških kober kot sta Naja nigricolis in Naja m. mossambica) ne povzročajo nevrotoksičnih, pač pa le kardiotoksične učinke in lokalne nekroze. Verjetno delujejo sinergistično s toksičnimi fosfolipazami.

 

Toksične fosfolipaze

            Fosfolipaze so široko razprostranjeni encimi tako med prokarioti kot evkarioti. Prednjačijo fosfolipaze A2, nekoliko manj je fosfolipaz C, bistveno manj pa fosfolipaz tipa A1, B in D. Največ toksičnih fosfolipaz je tipa A2. Toksične fosfolipaze so praviloma eksoencimi in le izjemoma lahko postanejo toksične tudi endofosfolipaze, ki pa jih morajo aktivirati zunanji toksini. Toksične fosfolipaze imajo raznovrstno delovanje in ne delujejo le na celične membrane, pač pa kažejo nevrotoksične učinke na presinaptičnih membranah, so miotoksične in vplivajo na eksocitozo. Raziskovanje delovanja toksičnih pa tudi netoksičnih fosfolipaz je pomembno zaradi sledečih razlogov:

1. Pomagajo nam razvozlati strukturne in funkcionalne lastnosti fosfolipidov in njihovo mediatorsko vlogo v številnih bioloških procesih, npr:

- pot fosfolipidnega metiliranja

- cikel fosfatidilinozitola

- vir arahnidonske kisline (ciklooksigenazni in lipooksigenazni sistem)

2. Fosfolipaze pomagajo pri študiju organizacije fosfolipidov v bioloških membranah.

- fosfolipidna asimetrija v eritrocitni membrani

3. Eksogene fosfolipaze so modeli sesalskih intracelularnih fosfolipaz, ki jih z običajnimi postopki ne moremo izolirati v zadostni količini.

4. Fosfolipaze so modeli za prepoznavanje nekaterih kliničnih metabolnih motenj, npr:

- epilepsije

- hemolize

- motenj v strjevanju krvi

- vnetja (povečana vsebnost arahnidonske k.)

5. Pomagajo nam razumeti kontrolne mehanizme in dogodke na presinaptični membrani

- uporaba b -bungarotoksina, noteksina in taipoksina.

Medtem ko so fosfolipaze tipa A1, B (LPL), C in D dokaj redke in zastopane v glavnem med mikroorganizmi, pa so fosfolipaze A2 široko razprostranjene. Poznamo tako netoksične endogene in eksogene encime pa tudi eksogene toksične fosfolipaze A2, ki so pogosto pomembna sestavina številnih kačjih in žuželčjih strupov.

Fosfolipaza A2

            Kot že rečeno so med vsemi fosfolipazami najbolj znane fosfolipaze A2. Znanih je okrog 50 različnih encimov (toksinov) iz kačjih strupov z določenimi primarnimi strukturami, ki kažejo veliko homolognost. Ti proteini, veliki od 12-16 kDa, so večinoma temperaturno obstojni, zlasti v kislem pH in jih težko denaturiramo. Njihovo delovanje je odvisno od Ca++ ionov. Kačje fosfolipaze A2 delimo po načinu delovanja na dve skupini. V prvo spadajo fosfolipaze, ki delujejo encimsko, njihova toksičnost pa je zelo majhna, v drugo skupino pa uvrščamo fosfolipaze s šibkim encimskim delovanjem in močno izraženimi nevrotoksičnimi (presinaptičnimi) lastnostmi. Zanimivo je, da med obema skupinama ni večjih strukturnih razlik, oba tipa fosfolipaz pa sta tudi močno podobna encimski fosfolipazi iz trebušne slinavke. Po drugi strani se npr. fosfolipaza A2 iz čebeljega strupa močno razlikuje od kačjih fosfolipaz, kljub temu pa je a.k. sekvenca okrog aktivnega centra (histidina) močno podobna. Nekatere kačje fosfolipaze imajo kvartarno strukturo, ki jo sestavlja več monomernih enot, te pa so v nekaterih primerih lahko kovalentno povezane.

            Sekundarna zgradba večine fosfolipaz je stabilizirana s sedmimi disulfidnimi mostički, le pri nekaterih le s šestimi. Zanimivo je, da so pri kačah iz družine gadov in klopotač disulfidne povezave na mestu 50 in na C-terminalnem delu molekule, medtem ko so pri strupenih gožih in morskih kačah ti mostički na mestu 11 in 77, tako kot pri fosfolipazi A2 iz pankreasa. Glede na te razlike fosfolipaze A2 delimo na dve skupini. Ne glede na razlike obstaja v vseh tipih 30 a.k. mest, kjer vedno najdemo enake aminokisline, ki so esencialne bodisi za katalizo bodisi za vezavo Ca++ bodisi za samo strukturo.

            Če Ca++ ni ali če ga nadomestimo z Ba++ ali Sr++ ioni encim ne bo aktiven. Ti ioni se vežejo v nekakšen žep, ki ga sestavljajo tri karbonilne skupine a.k in stranska skupina Asp 49. His 48 je udeležen v katalizi, pK se ob vezavi Ca++ zniža iz vrednosti 6.5 na vrednost okrog 5.5. Za katalizo sta nepogrešljivi še Asp na mestu 99 in Tyr 52. Fosfolipaza A2 torej ni klasična serinska esteraza (kot npr. acetilholin esteraza), ker v procesu katalize ne nastane aciliran encim in ne reagira z organofosfatnimi inhibitorji. Voda ima v hidrolizi fosfolipidov vlogo nukleofila, ki napade estersko vez.

            Kot smo že omenili delujejo fosfolipaze na več načinov in le eden od številnih farmakoloških učinkov je posledica encimskega delovanja - hidrolize membranskih fosfolipidov.

            Vzrok temu, da so nekatere fosfolipaze tako toksične, druge pa le šibko toksične (a v povprečju z veliko večjo encimsko aktivnostjo), je verjetno močno hidrofoben del molekule med 80 in 110 aminokislinskim ostankom, ki ga imajo le toksične fosfolipaze. Ta del verjetno reagira s presinaptično membrano. Miotoksične fosfolipaze pa imajo značilno kationsko mesto med ostanki 79-87. Ta del je močno hidrofilen, štrli iz globularno zvite molekule in naj bi bil vpleten v specifično prepoznavanje receptorjev na presinaptični membrani. Obstajalo naj bi še eno mesto odgovorno za nevrotoksične učinke, ki naj bi bilo precej oddaljeno od katalitičnega in vezavnega dela molekule. Ta del molekule ima obliko b -strukture.

            Najbolj znane nevrotoksične fosfolipaze so taipoxin iz avstralskega tajpana (Oxyuranus scutellatus), b -bungarotoksin iz tajvanskega krajta (Bungarus multicinctus), crotoxin iz klopotače (Crottalus durissus terrificus) in amoditoksini A-C iz našega modrasa (Vipera a. ammodytes).

            Toksične fosfolipaze blokirajo prenos živčnega vzburjenja, tako da inhibirajo sproščanje nevrotransmitorja acetilholina v sinaptične špranje med perifernimi in centralnimi živci ter med živčnomišičnimi povezavami, kar v končni fazi povzroči smrt zaradi respiratorne paralize. Čeprav mehanizem delovanja ni popolnoma znan, najnovejše raziskave kažejo, da ga sestavljajo tri faze. V prvi fazi pride do blokade sproščanja acetilholina v špranjo, temu pa sledi prehodna druga faza, za katero je značilno povečano sproščanje acetilholina, v tretji fazi pa pride do popolne in ireverzibilne blokade sproščanja acetilholina. Prvi dve fazi delovanja toksičnih fosfolipaz sta verjetno neodvisni od encimske aktivnosti, kar pa očitno ne velja za tretjo fazo, kjer je encimska fosfolipazna aktivnost neobhodno potrebna, da pride do popolne blokade živčnega vzburjenja. Začetna vezava toksina na presinaptično membrano poteka tako, da se toksična fosfolipaza veže na ustrezen membranski proteinski receptor, ki pa verjetno za vse fosfolipaze ni enak. Tiste fosfolipaze, ki niso toksične, se na te receptorje le šibko ali pa sploh ne vežejo.

            Za b -bungarotoksin, ki so ga predhodno radioaktivno označili z 125I, po vezavi pa povezali (cross-linking) z membranskim proteinom (na katerega se je toksin vezal) v presinaptični membrani, so ugotovili, da se veže na poseben podtip K+ kanalčka (na isti kanal se vežeta npr. tudi dendrotoksin iz mambe in škorpijonski karibdotoksin). Večina toksičnih fosfolipaz se veže na isti receptor, vendar ne vse. Poleg tega obstajajo tudi druga vezavna mesta, do katerih imajo nevrotoksične fosfolipaze večjo ali manjšo afiniteto, tako da ostaja natančen in splošno veljaven mehanizem vezave še vedno nepojasnen. Pri vezavi nekaterih fosfolipaz (npr. crotoksin) naj bi bili udeleženi tudi negativno nabiti fosfolipidi. Za taipoksin in crotamin so v zadnjem času ugotovili, da se lahko vežeta na receptorje, ki naj bi sodelovali pri transportu biogenih aminov (npr. norepinefrina, dopamina in serotonina, ne pa tudi acetilholina). Crotoksin in taipoksin v odsotnosti Ca++ (ki je potreben za fosfolipazno aktivnost) inhibirata od Na+ odvisen transport omenjenih biogenih aminov v celico že v 20-1000 nM konc.

Amoditoksin A

            Amoditoksin A je najbolj toksična sestavina modrasovega strupa (LD50 i.p. = 21 m g/kg miši. Je fosfolipaza A2, ki deluje nevrotoksično in ima tudi encimsko aktivnost. V modrasovem strupu najdemo še dve homologni nevrotoksični fosfolipazi amoditoksin B in C, ki sta nekoliko manj toksični in pa miotoksično fosfolipazo A2 amoditoksin L ter tri netoksične, kisle fosfolipaze I1-I3, ki imajo bazični His na katalitičnem mestu 47 zamenjan s kislo glutaminsko kislino.

            Amoditoksin A je bazična fosfolipaza, ki jo sestavlja ena sama polipeptidna veriga z mol. m. 14 kDa in It = 9.5. Čeprav se amoditoksin A po svojem delovanju ne razlikuje od drugih presinaptično delujočih toksičnih fosfolipaz, se njegovo vezavno mesto na presinaptični membrani očitno razlikuje od vezavnega mesta za b -bungarotoksin. Amoditoksin A si verjetno vezavno mesto deli z nekoliko manj toksičnima fosfolipazama, amoditoksinom B in C kot tudi z nevrotoksinom crotoksinom B iz južnoameriške klopotače (Crotalus durissus terrificus). Vezavo amoditoksina A delno prepreči fosfolipaza A2 iz gada (Vipera b. berus), medtem ko netoksična fosfolipaza I2 in amoditoksin L delujeta le kot zelo šibka inhibitorja. Kot popolnoma neučinkoviti v preprečevanju vezave amoditoksina A na membranski receptor pa so se pokazali b -bungarotoksin, a -dendrotoksin in crotoksin A (kisla podenota crotoksina).        Obdelava presinaptičnih membran z nekaterimi proteolitskimi encimi in nevroaminidazami ter toploto in zakisanjem so sicer zmanjšale, ne pa tudi preprečile vezavo toksina na membrane. Amoditoksin naj bi se vezal na membransko komponento z mol. m. med 53-56 kDa, vendar pa bi bil prav lahko povezan tudi z podtipom K+ kanalčkov (kar kažejo nekatere elektrofiziološke raziskave), ki pa so vsekakor drugačni od tistih, na katere se veže b -bungarotoksin.

 

Nevrotoksini

            Med nevrotoksine uvrščamo vse tiste toksine, ki kakorkoli vplivajo na prenos živčnega vzburjenja med živčnimi celicami ali med živci in mišicami in povzročajo simptome, ki so ali bi lahko bili povezani z motnjami v centralnem ali perifernem živčnem sistemu. V grobem jih delimo na:

1. Toksini, ki delujejo na ionske kanalčke (jih aktivirajo ali inhibirajo)

- inhibirajo/aktivirajo Na+ kanalčke

- inhibirajo/aktivirajo K+ kanalčke

- inhibirajo/aktivirajo Ca++ kanalčke itd.

2. Toksini, ki delujejo na postsinaptični membrani

- blokatorji/aktivatorji nikotinskih receptorjev

- blokatorji/aktivatorji muskarinskih receptorjev

- agonisti ali antagonisti drugih receptorjev (GABA, glutaminski receptorji)

- inhibitorji acetilholinesteraze

3. Toksini, ki delujejo na presinaptični membrani

- delujejo na procese, ki so povezani s transportom in eksocitozo (sproščanjem nevrotransmiterjev v sinaptično špranjo)

Nevrotoksini so proizvod številnih organizmov. So sestavine strupov mikroorganizmov, pajkov, škorpijonov, žuželk, številnih morskih živali, dvoživk in kač. Nevrotoksini so hudi strupi, ki zlahka povzročijo smrt zastrupljenega organizma. Kljub temu se nevrotoksinom lahko zahvalimo za številna spoznanja v nevrokemiji, nevrofiziologiji in farmakologiji, ki so posledica uspešne uporabe nevrotoksinov pri raziskavah procesov v centralnem in perifernem živčevju ter zlasti v sinapsah. Nevrotoksini, predvsem razni rastlinski alkaloidi, so snovi, ki so poznane že zelo dolgo, vendar poznamo tudi številne "novejše" nevrotoksine, katerih delovanje v marsikaterem primeru še ni popolnoma pojasneno. V okviru našega predmeta si bomo pogledali nekaj najbolj značilnih primerov nevrotoksinov, ki jih uvrščamo v eno izmed omenjenih skupin.

            Prenos vzburjenja po živčni mreži (dendriti, soma in akson) je sestavljen iz električnih dogodkov, v sinapsi pa v glavnem iz kemičnih dogajanj. Vsaka živčna celica sprejema signale iz številnih aksonov sosednjih živčnih celic preko dendritov. V somi vse sprejete signale pretvori v enoten signal, ki ga prek aksona in sinapse posreduje sosednjim celicam. Kako živčna celica pretvori kopico signalov v en sam signal ni popolnoma znano, uporaba določenih nevrotoksinov pa nam pomaga pri razvozljavanju teh procesov.

            Sinapsa je reža ali špranja med presinaptično membrano (terminalni del aksona) in postsinaptično membrano (membrana dendrita sosednje celice). Ker je sinaptična špranja preširoka, električni impulz ne more preprosto preskočiti na sosednjo celico, zaradi česar se vzburjenje prenese na kemični način preko nevrotransmitorja. Večina nevrotoksinov deluje prav na procese, ki potekajo na obeh membranah in v sinaptični špranji. Med sinapsami so najbolje preiskane tiste v motoričnih ploščicah (povezave med živcem in mišico). Nevrotransmitor je v perifernem živčevju acetilholin, ki ga iz acetil-CoA in holina sintetizira holinacetil transferaza. Acetilholin je v živčnem končiču spravljen v posebnih veziklih. Ko živčni impulz doseže živčni končič, ga depolarizira. Odpro se Ca++ kanalčki in kalcij vdre v celico. Kalcijevi kanalčki so zelo kompleksne molekule. Poznamo tri tipe (L,T,N). L kanalčke inaktivirajo nizke napetosti, T kanalčki se vedno inaktivirajo le prehodno, N kanalčki pa se inaktivirajo le ob negativnih membranskih potencialih. Najbolj pomembni so L-kanalčki. Ti kanalčki so tarča za številne nevrotoksine, kot so npr. w -konotoksin (iz nekaterih vrst polžev stožcev), leptinotarzin (iz koloradskega hrošča) in dinoflagelatni toksin - maitotoksin. Ko se ti kanalčki odpro, naraste konc. Ca++ v notranjosti živčnega končiča. Ker je Ca++ pomemben sekundarni sporočevalec, se aktivirajo številni proteini, npr. od Ca++/kalmodulina odvisna proteinska kinaza, ki fosforilira sinapsin I. To je protein, ki prekriva vezikle, v katerih je acetilholin. Fosforiliran sinapsin se loči od veziklov, kar omogoči, da pride do eksocitoze nevrotransmitorja v sinaptično špranjo. Acetilholin se veže na receptorje v postsinaptični membrani, v primeru motorične ploščice na nikotinske receptorje. Ti so integralni membranski proteini, ki konvertirajo ekstracelularni kemični signal (acetilholin) v intracelularni signal. Prevodnost postsinaptične membrane za Na+ ione močno naraste. Na+ vdre v celico skozi receptorsko nadzorovane Na+ kanalčke, zaradi česar pride do depolarizacije (ekcitirajoči postsinaptični potencial) postsinaptične membrane in skrčitve mišice. Hkrati acetilholin disocira z receptorja in se razgradi z encimom acetilholinesterazo. Razpadna produkta acetil in holin se vrneta v živčni končič s t.i. visokoafinitetnim transportnim sistemom in se nato porabita za sintezo novih molekul acetilholina. Za vsakega od opisanih dogodkov obstaja vsaj en specifičen toksin, ki s svojim delovanjem poruši prenos živčnega vzburjenja na efektor (mišico). Večina naravnih toksinov deluje na procese v pre- ali postsinaptični membrani in le redki na acetilholinesterazo, nasprotno pa najmočnejši umetni strupi (organofosfati) inhibirajo prav acetilholinesterazo in na dogodke v samih membranah ne vplivajo.

            Nekaj o presinaptičnih toksinih smo že povedali, ko smo obravnavali toksične fosfolipaze. Te pa niso edini nevrotoksini s presinaptičnim delovanjem, čeprav o mehanizmih delovanja teh toksinov ni veliko znanega. Najbolj so raziskani toksini, ki delujejo na napetostno odvisne Ca++ kanalčke. Nekateri toksini lahko te kanalčke inhibirajo, drugi pa aktivirajo. Kadar pride do aktivacije, intracelularna konc. kalcija naraste, kar vodi k paralizi zaradi nezadostne količine nevrotransmitorja. Podoben učinek dosežejo tudi toksini, ki inhibirajo Ca++ kanalčke le da je vzrok tokrat drugačen. Ca++ tokrat ne more v celico, kar povzroči, da se nevrotransmitor ne more sprostiti v sinaptično špranjo.

            Najbolj razvpita presinaptična toksina sta mikrobnega izvora. Klostridijska toksina botulinum in tetanus toksin sta v bistvu metaloproteinazi, ki delujeta tako, da cepita nekatere proteine v presinaptični membrani, vplivata na eksocitozo in tako preprečita prenos živčnega vzburjenja.

            Glavna tarča toksinov, ki delujejo postsinaptično, so acetilholinski receptorji. Poznamo nikotinski tip receptorjev (sinapse perifernega živčevja in motorična ploščica) in muskarinski tip receptorjev (v glavnem v centralnem živčevju in v gladkih mišicah). Receptorji so sestavljeni iz treh funkcionalnih delov. Prvi del prepozna nevrotransmitor in ga veže. To sproži določen učinek, ki je posledica sprostitve sekundarnega sporočevalca v intracelularni prostor. Ta drugi del, imenovan tudi efektor, lahko predstavlja ionski kanalček, če je sekundarni sporočevalec Ca++ ali pa nek encim kadar je sekundarni sporočevalec cAMP, cGMP, IP3 ali DAG). Tretjo molekulo receptorskega sistema predstavlja povezovalec (transduktor), ki povezuje receptorski in efektorski del. Receptor (vezavni del), povezovalec in efektor so lahko integralni deli ene proteinske molekule (receptor tipa I) ali pa so locirani na ločenih proteinih, ki pa se lahko ob različnih stanjih membrane povežejo in nato spet ločijo. Nikotinski receptorji za acetilholin so tipični receptorji tipa I. V tem primeru je efektorski del ionski kanalček, ki je povezan z vezavnim mestom, to pa leži na dveh od petih polipeptidnih verig, ki sestavljajo kanalček. Transduktor je v tem primeru prav tako integralni del heteropentameričnega receptorja. Vezava acetilholina na vezavno mesto sproži alosterično spremembo konformacije. Kačji a -toksini (npr. a -bungarotoksin) so kompetitivni antagonisti nikotinskih acetilholinskih receptorjev in se vežejo na podobno mesto kot d-tubokurarin oz. na receptorski del molekule. Nekateri nevrotoksini iz žab listavk kot je npr. histrionikotoksin pa se veže na efektorski del receptorja, torej v ionski kanalček.

            Med receptorje tipa I spadajo tudi receptorji za glicin, d -aminomasleno kislino (GABA) in glutamat. Vsi našteti receptorji so v bistvu kanalčki, ki predstavljajo efektorski del molekule. Glicinski in GABA receptorji so inhibitorni, ker ob aktivaciji prepuščajo Cl-, to pa vodi k hiperpolarizaciji živčne celice. Ti receptorji so tarče za številne toksine, med drugim za strihnin, ki se veže v kanalček glicinskega receptorja, medtem ko so pikrotoksin in nekateri toksini pajkov antagonisti receptorjev GABA. Glutamatni receptorji so v nasprotju z prejšnjima receptorjema vzburjajoči receptorji v živčnih celicah centralnega živčevja, ker depolarizirajo živčno celico, saj odpirajo kationsko selektivne kanalčke.

            Drugačen način prenosa srečamo pri receptorjih tipa II. Med te receptorje uvrščamo b -adrenergične receptorje ter nekatere druge podobne receptorje. Pri teh receptorjih igrajo glavno vlogo transduktorske molekule. Signal se prevede preko posebnih G-proteinov, ki ga prenesejo iz receptorja na efektor. V primeru adrenergičnih receptorjev je to encim adenilat ciklaza. Posledica je zvečanje konc. intracelularnega sekundarnega sporočevalca cAMP. G-proteini so skupina heterotrimernih proteinov. Njihova kvartarna struktura je a ,b ,g , skupna mol. m. pa je 83 kDa. Efektorski encim adenilat ciklaza se lahko ob prenosu signala stimulira ali inhibira, kar je odvisno od tega ali je receptorski del kompleksa tak, da veže stimulirajoč ali inhibitoren dejavnik in ali je receptorski del povezan z efektorjem s stimulatornim ali inhibitornim dejavnikom. G-proteini poleg adenilat ciklaze regulirajo tudi delovanje nekaterih drugih encimov (efektorjev) kot so cGMP-fosfodiesteraza, fosfolipaza C in NADH oksidaza, vplivajo pa tudi na delovanje Ca++ in K+ kanalčkov.

            Z receptorskimi kompleksi tipa II najpogosteje reagirajo bakterijski eksotoksini. Ti toksini blokirajo G-proteine z ADP-riboziliranjem. Toksini katalizirajo prenos ADP-riboze iz intracelularnega NAD+ na a podenoto G-proteinov bodisi na arginin (kolera toksin) ali na cistein (pertusis toksin). Kolera toksin tako povzroči permanentno aktivacijo stimulatornega G-proteina in tako tudi adenilat ciklaze. Posledica je povečana konc. cAMP to pa poruši transport vode in ionov skozi plazmatske membrane. Pertusis toksin ima podoben učinek na nivo cAMP v celici, vendar to doseže na drugačen način. Povzroči ADP-ribozilacijo a podenote inhibitornega G-proteina. Inhibitorni G-protein tako ne more več nadzirati delovanja adenilat ciklaze, zato konc. cAMP naraste. Bakterijski toksini, kot sta toksin kolere in oslovskega kašlja torej nista klasična nevrotoksina, saj pacientu ne povzročata neposrednih nevroloških motenj, pač pa sta zanimiva zato, ker vplivata na prenašanje in prevajanje signalov v ekcitacijskih membranah.

Drug podtip receptorjev II so muskarinski receptorji za acetilholin. Tudi ti receptorji so verjetno povezani z efektorji preko posebnih G-proteinov. V tem primeru pa efektor ni adenilat ciklaza, pač pa fosfolipaza C, sekundarni sporočevalec pa ni cAMP ampak inozitol-1,4,5-fosfat (IP3) oz. diacil glicerol (DAG). Muskarinski acetilholinski receptorji (obstajalo naj bi pet podtipov) so dobili ime zato, ker se na njih veže muskarin, ki je agonist v holinergičnih sinapsah gladkih mišic in v centralnem živčnem sistemu. Muskarin je alkaloid, ki ga najdemo v livkah in nekaterih mušnicah. Poleg drugih učinkov povzroča tudi halucinacije. Nasproten učinek pa ima alkaloid atropin in je torej antagonist za muskarinske receptorje.

 

Kanalčki, ki ustvarjajo akcijski potencial v živčni celici (nevronu)

            Vzburjenje se širi po živčni mreži z akcijskim potencialom. Plazmatske membrane živčnih celic (pa tudi drugih celic) so polarizirane. Membranski potencial normalno polarizirane celice je 70 do 90 mV in je negativen na notranji strani membrane. Potencial nastane zaradi neenake razporeditve ionov znotraj in zunaj celice. Akcijski potencial je zbir depolarizacij in repolarizacij membrane nevronov. Depolarizacijo povzroči hiter vdor Na+ ionov v celico in nekoliko zakasnjeno izhajanje K+ ionov iz celice. Tako natrijevi kot kalijevi ioni potujejo preko membrane skozi posebne, različne kanalčke, ki pa so v obeh primerih napetostno odvisni. Ti kanali so integralni membranski glikoproteini. Vsak kanalček sestavljata dve funkcionalno različni enoti: vrata (gate), ki odrejajo kdaj in koliko časa bo kanalček odprt, in selektivni filter, ki odreja kateri ioni lahko prehajajo skozi kanalček.

Na+ kanalčki

Na+ kanalčki imajo tri funkcionalna stanja:

- aktivacijo (odprtje kanalčka)

- stanje maksimalne prevodnosti, skozi popolnoma odprt kanalček

- inaktivacijo (zaprtje kanalčka)

Vsak od teh procesov je lahko tarča za določen toksin, tako poznamo toksine, ki delujejo na vse tri procese hkrati, pa tudi take, ki delujejo le na enegega od procesov, medtem ko na druga dva sploh ne vplivajo. Zaradi tega so toksini neprecenljivo orodje pri študiju širjenja živčnega vzburjenja vzdolž nevrona. Z uborabo nekaterih škorpionskih toksinov lahko tako preprečimo inaktivacijo kanalčka, to pa nam omogoči natančnejši vpogled v kinetiko drugih dveh procesov. Tetrodotoksin (TTx) učinkovito blokira le odprt kanalček in ne vpliva na procese aktivacije in inaktivacije. Glede na današnje znanje je Na+ sestavljen iz treh funkcionalnih enot in sicer iz selektivnega filtra, dela, ki je odgovoren za aktivacijo in dela, ki je odgovoren za inaktivacijo kanalčka. Na vsakega izmed omenjenih delov se lahko vežejo različni toksini, zato ta mesta imenujemo tudi vezavno mesto 1,2 in 3. Poleg teh treh obstaja še četrto vezavno mesto, kamor pa se vežejo nekateri škorpijonski beta toksini in nekateri lokalni anastetiki. V zadnjem času so odkrili še 5. vezavno mesto, kamor naj bi se vezali nekateri toksini kot npr. ciguatoksin.

            Celoten kompleks Na+ kanalčka je velik glikoprotein (260 kDa), ki je zvit in vrinjen v celično membrano aksona. Primarno strukturo so določili z cDNA kloniranjem in sekveniranjem. Dobljene kanalčke pa so rekonstituirali v jajčecih afriške žabe krempljičarke (Xenopus laevis). Nekateri Na+ kanalčki naj bi imeli še dve dodatni polipeptidni verigi, katerih funkcija pa ni znana.

            Biokemijska struktura Na+ nam zaenkrat ne zadostuje, da bi lahko natančno pojasnili mehanizem delovanja. Na+ ne prehajajo skozi kanal s preprosto difuzijo. Kanalček je približno 12 x bolj prevoden za Na+ kot za K+ in praktično neprevoden za anione. Kanalček lahko nasičimo z visoko konc. Na+ ionov (pri 368 mM konc. Na+ prevodnost pade za polovico). Kanalčki po tej plati nekoliko spominjajo na tipične transportne proteine, vendar je prevodnost za Na+ bistveno večja (107 ionov/sek) kot pa bi bila, če bi imeli opravka z navadnimi transportnimi proteini. Znotraj kanala obstaja vezavno mesto, kamor se z majhno afiniteto vežejo Na+ ioni, kar je verjetno razlog za selektivnost kanalčka in je povezano s potrebno dehidracijsko energijo, ki odtrga ion iz vezavnega mesta oz. ga vsaj delno odtrga iz hidratacijskega plašča. To vezavno mesto verjetno odgovarja vezavnemu mestu 1 kamor se vežejo tudi tetrodotoksin in podobne spojine. O molekularni arhitekturi tega mesta je le malo znanega. Očitno je dovolj nespecifično, da veže tako različne spojine kot sta tetrodotoksin in saksitoksin. Obema toksinoma je skupna le pozitivno nabita gvanidino skupina, drugače pa sta si strukturno popolnoma različna. Oba toksina delujeta le pri pH nižjem od 8.0 in blokirata kanalček le, če ju dodamo na zunanjo stran živčne membrane. Tetrodotoksin ne blokira vseh Na+ kanalčkov, tako npr. nima vpliva na delovanje Na+ kanalčkov v srčnih mišicah. Saksitoksin in tetrodotoksin se torej vežeta na mesto 1, ki je povezano z odprtim kanalčkom. Vezavni mesti 2 in 3 za selektivnost kanalčka nista pomembni, pač pa uravnavata odpiranje in zapiranje kanalčka. Alkaloidni toksini iz žab listavk, kot je npr. batrahotoksin in nekateri drugi alkaloidi ter številni lipofilni toksini steroidnega tipa ter brevetoksini se vežejo na mesto 2. Vezava toksinov na mesto 2 ima kompleksne posledice. Ti toksini aktivirajo kanalček, ga odpro. Alkaloid veratridin se npr. uporablja za depolarizacijo. Za lipofilne toksine smatrajo, da so alosterični efektorji, ki olajšajo prehod iz mirujoče faze v stanje odprtega kanalčka. Poleg tega upočasnijo inaktivacijo, do določene mere pa vplivajo tudi na selektivnost kanalčka.

Mesto 3 je vezavno mesto za številne toksine iz morskih vetrnic in škorpijonov. Ti toksini podaljšajo akcijski potencial, ker upočasnijo inaktivacijo kanalčka (vzdržujejo odprto stanje). Že omenjeni beta-škorpijonski toksini pa se verjetno vežejo na mesto 4, s čimer spremenijo aktivacijo in hkrati inhibirajo inaktivacijo Na+ kanalčkov.

K+ kanalčki

            O strukturi in K+ kanalčkov vemo precej manj kot o topografiji Na+ kanalčkov. Verjetno obstaja nekaj podtipov, ki so lastni določenemu tipu tkiva. Najbolj raziskani so napetostno odvisni K+ kanalčki in visokoprevodni od Ca++ odvisni K+ kanalčki. Kljub temu, da o sami strukturi teh kanalčkov ne vemo veliko, se zdi, da je njihova zgradba enostavnejša od zgradbe Na+ kanalčkov. Napetostno odvisni K+ kanalčki se odprejo malenkost za aktivacijo Na+ kanalčkov, ko pride do depolarizacije. K+ ioni tako začno izhajati iz živčne celice in povečajo depolarizacijo. Odprti ostanejo toliko časa, dokler je membrana depolarizirana, zato jih imenujemo napetostno odvisni kanalčki. V nasprotju s številnimi toksini, ki delujejo na Na+ kanalčke, poznamo le malo takih, ki vplivajo na prevodnost K+ kanalčkov. Apamin, nevrotoksična sestavina čebeljega strupa, ter karibdotoksin in sorodni toksini iz škorpijonskih strupov, dendrotoksini iz mamb, v zadnjem času pa tudi nekateri toksini iz morskih vetrnic, so edini poznani specifični inhibitorji K+ kanalčkov, vendar so nekateri podtipi kalijevih kanalčkov neobčutljivi za apamin. K+ kanalčke blokirajo tudi tetraetilamonij ter aminopiridini, vendar ne zelo specifično. Tudi delovanje kalijevih kanalčkov je sestavljeno iz njihovega odpiranja in zapiranja ter iz posebnega filtra, ki je odgovoren za selektivno prepustnost kanalčka. Natrijevi in litijevi ioni sicer gredo skozi kanalček, a bistveno počasneje od kalijevih ionov. K+ kanalčki naj bi imeli obliko nekakšnega lijaka, ki skozi ožino prepušča le K+ ione. Z uporabo škorpijonskih toksinov, ki imajo znano sekvenco in trodimenzionalno strukturo, so razvozljali nekatere strukturne značilnosti napetostno odvisnih K+ kanalčkov. Odsek v sekvenci K+ kanalčkov, ki naj bi predstavljal vezavno mesto za škorpijonske toksine so imenovali mesto P. Predstavlja ga odsek kakih 40 aminokislin, ki vsebuje vsa vezavna mesta za toksine, kot tudi esencialne negativne naboje, ki obdajajo kanalček in so odgovorni za ionsko selektivnost. Posamezen kanalček naj bi sestavljal tetramer. Trenutno poznamo štiri aminokislinske pare, ki sodelujejo pri vezavi škorpijonskih toksinov na kanalček.

 

Nekateri toksini, ki delujejo na Na+ kanalčke:

 

1. alkaloidi

- akonitin (Aconitum napellus)

- grajanotoksini (iz različnih rastlin rodov Rhododendron, Kalmia, Leucothoe in družine Ericacea)

- veratridin (in nekaterih lilijevk, zlasti rod Veratrum)

2. tetrodotoxin, saksitoksin in podobni toksini dinoflagelatnih alg

3. Toksini iz strupenih žab listavk (podrevnic)

- batrahotoksin

4. nevrotoksini morskih vetrnic

5. škorpijonski toksini

6. brevetoksini in ciguatoksin

7. konotoksini

- m -toksini

 

Tetrodotoksin in saksitoksin

            Meso in zlasti nekateri notranji organi rib četverozobk (Tetradeontidae) ter nekaterih drugih rib, kamor spadajo številne vrste napihovalk, na japonskem znanih kot kulinarična specialiteta "fugu", vsebujejo tetrodotoksin, letalni toksin, ki deluje na Na+ kanalčke. Toksičnost napihovalk je različna od vrste do vrste, od letnega časa in celo od primerka do primerka iste vrste. TTx najdemo tudi v nekaterih drugih organizmih kot so morske zvezde, polži, raki in školjke, pa tudi v nekaterih dvoživkah. Strup avstralske modroobročkaste hobotnice (Hapalochlaena maculosa) tudi vsebuje tetrodotoksin, ki ga hobotnica celo aktivno vbrizga v žrtev. TTx je zelo podoben chiriquitoksin iz neotropske žabe Atelopus chiriquiensis, ki se od tetrodotoksina razlikuje le po tem, da na mestu 6 nima CH2OH skupine, le-ta pa je nadomeščena z neko neznano skupino. Obstaja mnenje, da je vsaj v morju TTx proizvod mikroorganizmov, ali pa vstopi v prehranjevalno verigo prek organizmov, ki se prehranjujejo s sedimentom. V koži ene izmed napihovalk so našli bakterijo iz rodu Pseudomonas, ki proizvaja TTx tudi v bakterijski kulturi. TTx proizvajajo tudi številne bakterije iz rodu Vibrio. Toksične vrste napihovalk in že omenjena hobotnica so proti TTx neobčutljive, kar kaže na visok tolerančni prag teh živali.

            Tetrodotoksin inhibira Na+ kanalčke, tako da onemogoči tok Na+ ionov v celico, zaradi česar ne pride do depolarizacije. TTx se veže na kanalček in ne vpliva na napetostno odvisnost aktivacije in inaktivacije kanalčkov. Vezavo TTx preprečimo s saksitoksinom (STx), s katerim si delita isto vezavno mesto. TTXx in STx se vežeta na kanalček neodvisno od stanja kanalčka (počivajoč, inaktiviran, odprt). Pri vezavi TTx na receptor sta najbolj pomembni gvanidinska in karboksilna skupina. S pomočjo oznančenega (3H)-TTx so razvozljali topografijo in gostoto Na+ kanalčkov v živčnih celicah.

            Saxitoksin je morski toksin, ki je produkt dinoflagelatnih alg in se v obdobju prekomernega "cvetenja" teh alg kopiči v hepatopankreasu nekaterih, sicer užitnih, školjk. Najpogosteje ga najdemo v klapavicah vrste Mytillus californianus ter zlasti ob pacifiški vrsti Saxidomus giganteus, od koder tudi njegovo ime. STx povzroča zastrupitve s školjkami, ki so v hepatopankreasu akumulirale velike količine STx. Obolenje se imenuje PSP (paralitic shellfish poisoning), zanj pa ni protistrupa in se v 1-10% primerov konča s smrtjo. STx tako kot TTx blokira Na+ kanalčke. Prvi simptomi se pojavijo od 30 do 60 min po zaužitju strupenih školjk. Simptomi so podobni kot pri zastrupitvi s TTx in vodijo v respiratorno paralizo. Letalna doza za oba toksina je okrog 10 m g/kg miši. Kot že rečeno so vir saksitoksina dinoflagelatne alge iz rodov Alexandrinium (Protogonyalax, Gonyaulax) in Pyrodinium. Strukturni analogi saksitoksini so različni goniautoksini, ki imajo podobne lastnosti.

Batrahotoksin

            Batrahotoksin je predstavnik toksinov, ki so lipofilni in se vežejo na mesto 2 Na+ kanalčkov. Batrahotoksin so izolirali iz številnih vrst neotropskih žab listavk iz rodu Phylobates. Najbolj znana vrsta je P. terribilis, katerih kožne žleze vsebujejo kar 500 m g batrahotoksina, kar je od 25-3000 x več kot ga imajo druge listavke. Batrahotoksin uporabljajo južnoameriški indijanci za premaze konic puščic, zato se žabe listavke v angleščini imenujejo "poisson arrow frogs". Batrahotoksin je nekakšen derivat steroidnih alkaloidov in ima številne posebnosti, ki jih ne najdemo pri drugih naravnih spojinah. Izvor batrahotoksina, ki ga žabe kopičijo v kožnih žlezah ni poznan. Zastrupitev z batrahotoksinom vodi v takojšnjo paralizo, smrt pa nastopi tudi zaradi kardiotoksičnih učinkov. Toksin je eden najmočnejših depolarizatorjev, vendar pa so same žabe dokaj odporne proti njegovemu delovanju. Batrahotoksin povzroča močno depolarizacijo tako, da onemogoči inaktivacijo Na+ kanalčka. Ta učinek je praktično ireverzibilen na vseh tkivih, razen v nevroblastih. Delovanje batrahotoksina lahko preprečimo in izničimo s TTx in STx. Ta učinek pa je nekompetitiven, kar lepo kaže, da se TTx in STx vežeta na drugo vezavno mesto kot batrahotoksin. Batrahotoksin je tudi močan blokator aksonalnega transporta in se tudi v tem loči od tetrodotoksina. Kardiotoksično delovanje batrahotoksina je posledica depolarizacije Na+ kanalčkov v srčni mišici.

Nevrotoksini morskih vetrnic

            Poleg že omenjenih citolitičnih toksinov vsebujejo številne vetrnice tudi nevrotoksične toksine, ki se vežejo na mesto 3 Na+ kanalčkov in preprečijo njihovo inaktivacijo. Na ta način podaljšajo depolarizacijo živčne ali mišične celice. Te toksine so izolirali iz številnih morskih vetrnic, med drugim tudi iz voščene morske vetrnice (Anemonia sulcata). Morske vetrnice vsebujejo dva polipeptidna tipa nevrotoksinov; t.i. kratke in dolge toksine. Prvi imajo mol. m. med 2000-3000 Da, drugi pa med 4000-6000 Da. Dolgi toksini imajo od 45-49 aminokislinskih ostankov in precejšnjo homologijo v aminokislinskem zaporedju. Zlasti konzervativna so mesta, kjer so Cys povezani z disulfidnimi mostički (obstajajo tri take povezave). Negativno nabita asparaginska kislina na mestu 7 in pozitivno nabita amino skupina lizinskega ostanka na mestu 37 naj bi sodelovala v "aktivnem (toksičnem) centru". Zanimivo je, da so na delovanje nevrotoksinov iz morskih vetrnic veliko bolj občutljivi raki kot sesalci. Pri sesalcih ti toksini verjetno delujejo kardiotoksično, kar se odraža v močnem pozitivnem inotropnem delovanju na srčno muskulaturo. Nevrotoksini morskih vetrnic zasedejo isto vezavno mesto (mesto 3) na Na+ kanalčku kot a -škorpijonski toksini. Nevrotoksini morskih veternic se raje vežejo na Na+ kanalčke tistih celic, ki niso občutljivi na delovanje tetrodotoksina (npr. na miotubule, nevroblaste in fibroblaste), kar kaže na to, da verjetno obstaja več podtipov Na+ kanalčkov.

Škorpijonski toksini

            Poznano tri tipe škorpijonskih toksinov, ki delujejo na Na+ kanalčke. a -toksini delujejo na isto mesto kot toksini morskih vetrnic, torej na mesto 3 in preprečijo inaktivacijo, ne vplivajo pa na aktivacijo kanalčka. Njihov učinek je napetostno odvisen in ga lahko izničimo z depolarizacijo membrane. b -toksini vplivajo na aktivacijo kanalčka, njihovo delovanje pa je napetostno neodvisno, končni učinek pa je depolarizacija živca. Ti toksini se vežejo na drugo vezavno mesto kot a -toksini (mesto 4). a -toksine vsebuje prevsem strup škorpijonov Starega sveta iz rodov Leirus, Androctonus in Buthus ter eden izmed toksinov ameriškega rodu Centruroides. Ta rod vsebuje drugače predvsem b -toksine. Tretji tip škorpijonskih toksinov so g -toksini (rod Tytus), ki vplivajo tako na aktivacijo kot tudi na inaktivacijo Na+ kanalčkov in imajo izmed vseh škorpijonskih toksinov do teh kanalčkov največjo afiniteto. Ta toksin naj bi se vezal na dodatno vezavno mesto (mesto "5"), ki pa ga niso okarakterizirali. Na to mesto naj bi se vezali tudi dinoflagelatni brevetoksini (Ptyshodiscus brevis, prej rod Gymnodinium), ki olajšajo aktivacijo Na+ kanalčka toksinom kot je batrahotoksin.

Toksini, ki delujejo na K+ kanalčke

V primerjavi s toksini, ki modulirajo Na+ kanalčke poznamo le nekaj toksinov, ki delujejo na različne podtipe K+ kanalčkov. Le-te delimo na napetostno odvisne K+ kanalčke in od Ca++ odvisne K+ kanalčke. Slednje pa delimo na dva podtipa, odvisno od občutljivosti na apamin. Toksine, ki delujejo na K+ so do zdaj izolirali iz čebel, škorpijonov, morskih vetrnic in kač.

- apamin iz domače čebele deluje na nekatere od Ca++ odvisne K+ kanalčke

- škorpijonski toksini delujejo na oba podtipa od Ca++ odvisnih K+ kanalčkov

- a -dendrotoksin iz mambe deluje na napetostno odvisne K+ kanalčke

- toksini iz morskih vetrnic blokirajo napetostno odvisne K+ kanalčke

- nekatere nevrotoksične fosfolipaze A2

Apamin

            Apamin v povprečju predstavlja le okrog 2% čebeljega strupa. Apamin je sestavljen iz 18 aminokislin, polipeptidna veriga pa je povezana z dvema disulfidnima mostičkoma. Če apamin vbrizgamo v poskusno žival pride do učinkov, ki jih lahko pripišemo delovanju na centralni živčni sistem. Apamin je očitno največji nevropeptid, ki lahko preči krvno-encefalno pregrado. i.v. LD50 za miši je razmeroma visoka (4 mg/kg), a se zniža za kar 1000-10000x, če apamin vbrizgamo intraventrikularno. V možganih se razporedi dokaj enakomerno. Povzroča izgubo koordiniranega delovanja med posameznimi deli centralnega živčnega sistema, kar pa ni posledica neposrednega uničenja možganskih celic. Apamin ne povzroča depolarizacije. Apamin se specifično veže v različnih tkivih na poseben 30 kDa receptor, ki je del večjega proteinskega kompleksa, od Ca++ odvisnega K+ kanalčka, ki ima razmeroma majhno prevodnost. Apamin blokira take kanalčke v zelo nizki koncentraciji (Kd = 40 pM). Zanimivo je da K+ kanalčki v normalni mišični celici nimajo receptorjev za apamin. Abnormalne mišice (npr. pri Sternertovi bolezni), embrionalne podganje mišice, neoživčene miocite v celični kulturi in denervirane mišice odraslih osebkov pa imajo take receptorje.

Karibdotoksin

            Karibdotoksin je škorpijonski toksin, ki so ga izolirali iz vrste Leiurus quinquestriatus.

Blokira od Ca++ odvisne K+ kanalčke, vendar ne tistih, ki jih blokira apamin, pač pa tiste, ki imajo veliko prevodnost. Afiniteta vezave na ta podtip kanalčka je zelo velika. Zelo podobna škorpijonska toksina sta iberotoksin in agatoksin. S pomočjo teh toksinov so dobili do zdaj največ informacij o topografiji K+ kanalčkov (t.i. shaker podtip).

Dendrotoksini

            Dendrotoksini so skupina nevrotoksinov, ki jih sestavlja ena sama polipeptidna veriga. Ti toksini nimajo enicmske aktivnosti in olajšujejo sproščanje nevrotransmitorja v perifernih in centralnih sinapsah. Izolirali so jih le iz elapidnih kač mamb (rod Dendroaspis). Ti toksini imajo sorazmerno majhno toksičnost in niso glavna sestavina mambinega strupa. So bazični polipeptidi, ki jih sestavlja od 57-60 aminokislin. Polipeptidna veriga je navzkrižno povezana s tremi disulfidnimi vezmi. Letalnost teh toksinov je razmeroma nizka, le 15-38 mg/kg miši i.v., na živčno-mišičnem preparatu pa že 20 nM koncentracije povzročijo zelo močne učinke, ki se kažejo v močni depolarizaciji in sproščanju acetilholina v sinaptično špranjo. Dendrotoksini ne vplivajo na acetilholinesterazo in tudi ne na nikotinske receptorje v postsinaptični membrani. Dendrotoksini delujejo tudi na gladke mišice. Z veliko afiniteto se vežejo tudi na sinaptosome v možganih. Dendrotoksini se vežejo na napetostno odvisne K+ kanalčke v številnih tkivih. Podobno kot dendrotoksini delujejo tudi nevrotoksini iz nekaterih vrst morskih vetrnic. Do zdaj poznamo le blokatorja K+ kanalčkov iz vrste Stichodactyla helianthus in Bunodossoma granulifera, ki pa se strukturno precej ločita od škorpijonskih toksinov in dendrotoksinov.

Postsinaptično delujoči toksini

            Med postsinaptično delujoče toksine uvrščamo vse toksine, ki delujejo na različne receptorje za nevrotransmitorje. Najbolj znan postsinaptični toksin je nedvomno kurare, ki ga južnoameriški Indijanci uporabljajo za pripravo strupenih puščic. Kurare poznamo v treh kemijskih oblikah. Pridobivajo jih iz različnih rastlin, ki spadajo v družini Menispermaceae in Loganiaceae. Poglavitni vir kurareja so rastline iz rodov Strychnos in Chondrodendron. Slednji rod vsebuje predvsem d-tubokurarin. Toksiferin ali c-kurarin najdemo v rastlini Strychnos toxifera. C-kurarin je najbolj močan strup med kurare alkaloidi.

            Alkaloidi kurareja povzročajo motorično oslabelost, ki ji sledi paraliza vseh mišic oživčenih z motoričnim živčevjem. Smrt nastopi zaradi respiratorne paralize. Umetno dihanje lahko izniči delovanje kurareja, ker je le-to kratkotrajno. C-kurare je približno 100 x bolj toksičen kot d-tubokurarin. Vse oblike kurareja se vežejo na receptorje za acetilholin, zato delujejo le na holinergične sinapse. Zelo učinkovit protistrup je neostigmin, ki je inhibitor acetilholinesteraze. Povečana količina acetilholina v sinaptični špranji izpodrine kurare iz nikotinskih receptorjev.

Kačji postsinaptični toksini

            Kačji toksini se vežejo na receptorje bistveno močneje kot kurare, vezava je skoraj ireverzibilna. Postsinaptično delujoči kačji toksini so sestavina številnih kačjih strupov elapidnih kač (strupenih gožev kot so krajti, mambe in kobre) in morskih kač. Znana je primarna zgradba kakih 80 toksinov, ki se vežejo na nikotinske receptorje za acetilholin. S pomočjo teh toksinov smo se naučili veliko novega o zgradbi in načinu delovanja nikotinskih receptorjev. Vsi postsinaptično delujoči kačji toksini so razmeroma kratki bazični polipeptidi. ki jih glede na dolžino verige delimo na dve skupini. Krajši so sestavljeni iz 60-62 aminokislin, daljši pa iz 70-74 aminokislin. Krajši toksini imajo 4 disulfidne mostičke, daljši pa so povezani s petimi mostički. Od tega pravila odstopa le nekaj izjem. Vsi toksini so relativno temperaturno odporni, v vodnih razstopinah pa radi tvorijo agregate (dimere, trimere). Kljub različnim dolžinam polipeptidnih verig so tako kratki kot dolgi toksini precej homologni, pri vseh so enaka mesta, kjer najdemo cisteinske ostanke. Iz kristalne zgradbe (terciarne strukture) dveh dolgih in enega kratkega nevrotoksina lahko razberemo, da imajo vse tri molekule centralno jedro, ki ga povezujejo štirje disulfidni mostički, ven pa štrlijo tri zanke. Srednja zanka je najdaljša, dolgi toksini imajo prav na koncu te zanke dodatni, peti disulfidni mostiček.

            Ne glede na dolžino nevrotoksinov vsi delujejo enako, podobno kot kurare, le da se na nikotinske receptorje v holinergičnih motoričnih sinapsah vežejo veliko močneje. Njihovo delovanje ne moremo preprečiti z acetilholinesteraznimi inhibitorji fiziostigminskega tipa.           Vezava kačjih nevrotoksinov na receptorje, tako kot vezava kurareja, ne zmanjša zmožnosti prevajanja po samem živcu ali vzburljivosti mišice, blokira le prenos vzburjenja v sinapsi. Večina kačjih nevrotoksinov deluje le na prenos vzburjenja v motoričnih sinapsah (motorični ploščici), ne pa tudi na prenos vzburjenja med dvema živcema. Tipičen predstavnik te vrste toksinov je a -bungarotoksin. Nekateri nevrotoksini, kot sta k -bungarotoksin in k -flavitoksin pa specifično blokirajo prevajanje v živčnih vozlih in nimajo užinka na motorično ploščico. Aktivni center toksinov, ki delujejo na holinergične receptorje, je verjetno na koncu dolge zanke. Toksinska molekula pa verjetno ni rigidna in lahko v različnih razmerah zavzema različna konformacijska stanja (odvisno od pH, ionske jakosti itd.). Bližina Asp 31 in Arg 37 verjetno posnema strukturo acetilholina, medtem ko je konformacija, kjer sta v tesnem stiku dve bazični a.k. Arg 33 in Lys 47 z dvema aromatskima a.k. Trp 29 in Phe 32 podobna zgradbi kurare alkaloidov. Poskusi z izotopsko iodiranim, luminiscentnim in biotiniranim a -bungarotoksinom so nam dali vpogled v strukturo in funkcijo nikotinskih receptorjev.

            Nekatere toksične fosfolipaze lahko delujejo postsinaptično in tekmujejo za vezavna mesta z a -bungarotoksinom, čeprav je njihov učinek veliko manjši kot pri pravih postsinaptično delujočih kačjih toksinih.

Drugi toksini s postsinaptičnim delovanjem

a -konotoksini

            Ti toksini so majhni peptidi, ki vsebujejo od 13-15 a.k., N-terminalni del pa je amidiran. Izolirali so jih iz nekaterih vrst polžev rodu Conus, zlasti iz vrst C. geographus in C. magus. Ti toksini imajo zgradbo a -heliksa in so prečno povezani z dvema disulfidnima mostičkoma. Za vezavna mesta na nikotinskih receptorjih tekmujejo z d-tubokurarinom in a -bungarotoksinom, ne vplivajo pa ne prenos vzburjenja med samimi živci.

Lofotoksin

            Je edini znani nevrotoksin iz tropskih gorgonij, ki jih uvrščamo v rod Lophogorgia. Ta toksin ima precej nenavadno strukturo in je topen v organskih topilih. Kemijsko spada med diterpenoidne derivate, ki imajo furanoaldehidno in b -laktonsko skupino, nimajo pa kationskih kvartarnih ali terciarnih dušikovih atomov, ki so značilni za druge nevrotoksične alkaloide. Raziskave so pokazale, da se lofotoksin veže na nikotinske receptorje in jih ireverzibilno inaktivira. Lofotoksin se veže tudi na nikotinske receptorje v živčnih vozlih, nima pa vpliva na receptorje muskarinskega tipa (oz. na vezavo GABA na te receptorje), zato bi bil lahko koristno orodje pri študiju nikotinskih receptorjev v živčnih vozlih.

Surugatoksin

            Tudi ta toksin, ki so ga izolirali iz sicer užitnega morskega polža vrste Babylonia japonica (verjetno se tud nabira zaradi prehranjevalne verige in ni produkt samega polža), je močan antagonist nikotinskih receptorjev v ganglijih mačk in podgan, kot tudi tistih v tankem črevesju morskih prašičkov.

Anatoksin-a

            Anatoksin-a je proizvod sladkovodne cianobakterije Anabaena flos-aquae. Toksin povzroča smrt domačih in divjih živali, ki se napajajo z okuženo vodo. Smrt nastopi zaradi respiratorne paralize. Toksin je biciklični sekundarni amin. Povzroča blokado prenosa vzburjenja v živčno-mišičnih povezavah. Na acetilholinske receptorje se veže s trikrat večjo afiniteto od samega acetilholina. Zaradi vezave pride do zmanjšanja občutljivosti receptorja, čeprav ostane prevodnost receptorskega ionskega kanala nespremenjena. V možganski skorji podgan tekmujejo izomeri anatoksina-a za različna vezavna mesta, zaradi česar bi bil lahko anatoksin-a primerno sredstvo za raziskave različnih subpopulacij receptorjev v centralnem živčnem sistemu.

Toksini iz žab listavk (Histrionicotoksin, gefirotoksin in pumilotoksin C)

            Histrionikotoksin in gefirotoksin so najprej izolirali iz kožnih žlez žabe Dendrobates histrionicus, kasneje pa še iz nekaterih drugih vrst žab listavk. Izraz toksin morda ni najbolj primeren za opis obravnavanih alkaloidov, saj je njihova toksičnost relativno majhna. Kljub temu so ti "toksini" pomembni saj blokirajo kanalčke nikotinskih receptorjev. Njihovo vezavno mesto torej ni enako vezavnemu mestu d-tubokurarina ali a -bungarotoksina. Histrionikotoksin se veže na mesto znotraj kanala in tako blokira njegovo odprtje oz. aktivacijo, kadar se na receptorsko mesto veže ustrezen agonist (npr. acetilholin). Poleg tega pa zviša tudi hitrost inaktivacije. Toksin torej vpliva na samo prevodnost kanalčka. Histrionikotoksin se lahko veže tako v odprt kot tudi v zaprt kanalček, medtem ko se gefirotoksini lahko vežejo le v odprt kanalček. Kljub temu pa si oba toksina delita vezavno mesto.

            Pumilotoksin-C so izolirali iz panamske vrste žabe listavke Dendrobates pumilio, ki pa ga lahko najdemo tudi v drugih vrstah listavk. Njegova struktura je bolj enostavna kot strukture drugih kožnih alkaloidov. Verjetno deluje podobno kot prej opisana alkaloida, njegova toksičnost pa je razmeroma majhna (s.c. LD50 = 20 mg/kg miši).

Strihnin

            Strihnin je zelo dolgo in dobro znan strup. V farmakologiji se uporablja kot analeptik (budilo). Strihnin ima nenavaden mehanizem delovanja, ki na celičnem nivoju zavira, vendar v končni fazi z zaviranjem zavrtja pravzaprav vzburja. Mehanizem delovanja strihnina nekoliko spominja na delovanje tetanus toksina, ki pa deluje veliko počasneje in dlje in je zato tudi bolj nevaren. Strihnin je glavni alkaloid rastline Strychnos nux-vomica in nekaterih drugih rastlin istega rodu. LD50 za miši je okrog 0.5 mg/kg i.p. Strihnin sulfat, ki se največkrat uporablja je brezbarvna snov brez vonja, a izrazito grenkega okusa. Za zastrupitve s strihninom je značilen povečan refleksni odgovor kasneje pa se pojavijo močni krči, ki so posledica hudih skrčitev vseh progastih mišic. Smrt nastopi zaradi zadušitve, ki je posledica medularne ohromitve. Strihnin povzroči selektivno blokado postsinaptičnih zaviralnih mehanizmov v centralnem živčevju. Ker se tako vsa osrednježivčna vzburjenja po prenehanju postsinaptičnega zaviranja neomejeno širijo, sledijo slehernim čutnim zaznavam (vzburjenju) hudi napadi krčev.

            Začetna strihninska blokada je posledica antagonističnega strihninskega vpliva na inhibitorni nevrotransmitor glicin (glicin aktivira postsinaptično zaviranje), ki se veže na postsinaptične receptorje motoričnih in vmesnih nevronov odgovornih za postsinaptično zaviranje vzburjenja v hrbtenjači.

 

Toksini z lokalnim delovanjem

            Številni toksini lahko prodro v telo preko kože, pri tem pa povzročijo različne poškodbe na koži, podkožnem vezivnem tkivu, ožilju in mišicah. Med toksine z lokalnim delovanjem uvrščamo tiste snovi, ki organizem vsaj neposredno ne prizadenejo sistemsko, pač pa le bolj ali manj omejeno-lokalno. Med take strupe uvrščamo zlasti toksine številnih kač, v manjši meri pa tudi strupe nekaterih ožigalkarjev, rib in pajkov. Te toksine bi lahko v grobem razdelili na:

-toksine z miotoksičnim delovanjem

-toksine s hemoragičnim delovanjem

-toksine z dermonekrotičnim delovanjem

Delovanje teh tipov toksinov ni popolnoma ločeno, saj večina deluje vsaj na dva od omenjenih sistemov.

 

Miotoksini

Miotoksine delimo na dve skupini:

a) miotoksini z majhno molsko maso

b) miotoksini z fosfolipazno A2 aktivnostjo

Majhni miotoksini so bazični proteini (okrog 4-5 kDa, It > 9.0) brez encimske aktivnosti, fosfolipaze pa so encimi veliki med 12 in 16 kDa. Oboji delujejo na skeletne mišice. Fosfolipaze smo že omenili kot presinaptične nevrotoksine, nekateri od teh toksinov pa lahko delujejo tudi miotoksično. Njihovo delovanje je v bistvu mionekrotično, kar privede pri hudih zastrupitvah celo do izgube delov okončin, pri manj hudih zastrupitvah pa se lahko deli mišic regenerirajo. Miotoksične komponente so pogoste v strupih gadov in jamničark, najdemo pa jih tudi pri nekaterih elapidnih avstralskih kačah. Nizkomolekularne miotoksine premorejo le klopotače (rod Crotalus), vendar o njihovem mehanizmu delovanja ne vemo prav dosti. Dva izmed omenjenih toksinov-crotamin in miotoksin očitno povečata prevodnost Na+ kanalčkov. Mikroskopski pregled tkiva, v katerega so vbrizgali kratke miotoksine je pokazal, da se mišične celice napihnejo (vakuolarizirajo), kar po 48 urah privede do nekroze. Spremembe so vidne predvsem pri sarkoplazmatskem retikulumu, ki se močno napihne, poveča pa se tudi perinuklearni prostor. Sarkoplazmatski retikulum tako zavzame večino citoplazme, nato pa poči in se razprši v številne majhne vakuole, hkrati pa pride tudi do razpada miofibril. Tudi mitohondriji so malenkost napihnjeni, vendar ne popolnoma uničeni. T-tubuli izgledajo normalno, medtem ko miofilamenti med "Z" regijami počasi razpadajo. Sarkolema in bazalana lamina nekrotičnih celic ostajata nepoškodovani.

            Bolje so preučene fosfolipaze, ki pa delujejo zelo raznoliko, saj poškodujejo membrane, inhibirajo strjevanje krvi, povzročajo hemolizo in mionekroze, so kardiotoksične in nevrotoksične, prevladujoče posamezne aktivnosti pa so od fosfolipaze do fosfolipaze različne. Miotoksične fosfolipaze so našli predvsem pri azijskih jamničarkah, v strupih avstralskih strupenih gožev in pri eni vrsti vodnih kač. Patogeneza, ki je povezana z toksičnimi fosfolipaznimi miotoksini je sledeča:

1. toksin poškoduje plazmatsko membrano mišične celice, kar vodi v hiperkontrakcijo miofibril. V začetku se pojavi tudi močna oteklina.

2. v citoplazmi nastanejo gosto prepleteni skupki miofibril.

3. v delih citoplazme miofibrile izginejo, bazalna lamina pa ostane nepoškodovana.

4. v roku 24 ur pride do poškodb mitohondrijev, disperzije miofibril in razpada miofilamentov (aktin, miozin).

5. pojavijo se številni fagociti, ki odstranjuejo razpadle celične ostanke.

Patogeneza miotoksičnih fosfolipaz je verjetno povezana z njihovim delovanjem na fosfolipide v plazmatskih membranah mišičnih celic.

Hemoragični toksini

            Tudi hemoragične toksine navadno delimo glede molekulske mase na hemoragine z nizko molsko maso (22-26 kDa) in hemoragine z visoko molsko maso (60-90 kDa). Vsi poznani hemoragični toksini so brez izjeme proteinaze, številni med njimi so tudi fibrinogenaze, ki hidrolizirajo fibrinogen in tako preprečijo strjevanje krvi. Hemoragične toksine imajo v svojih strupih predvsem gadi, azijske jamničarke in klopotače. Hemoragini delujejo tako, da uničijo endotelij kapilar, poškodovane kapilare pa začno prepuščati eritrocite v lokalno tkivo. Mehanizem prehoda eritrocitov skozi poškodovan endotelij poteka na dva načina, z diapedezo ali "per rhexis". Hemoragični toksini navadno vodijo v močne kožne in podkožne krvavitve. Hemoragini napadejo bazalne membrane endotelnih celic, jih poškodujejo in omogočijo prehod eritrocitov v lokalno tkivo. Hemoragini so metaloproteinaze, ki večinoma vsebujejo Zn kot esencialni kofaktor. Hemoragini so večinoma kisli proteini, le nekaj izjem ima It v bazičnem. Proteolitsko delovanje hemoragičnih proteinaz ni podobno delovanju kimotripsina ali tripsina. Na podlagi študij z inzulinom kot substratom so ugotovili, da jih večina cepi vez Ala(14)-Leu(15) ter tudi vezi med His(10)-Leu(11), Gly(23)-Phe(24) in vez med Tyr(16) in Leu(17). Hemoragini delujejo izredno hitro, nekateri po daljšem času delujejo tudi mionekrotično, vendar ta učinek verjetno, vsaj pri večini hemoraginov, ni posledica direktnega delovanja, pač pa lokalne ishemije. Kot smo že omenili hemoragije nastanejo na dva načina, z diapedezo in "per rhexis". Pri prvem načinu so luknje med celicami kapilarnega endotelija majhne, tako da se eritrocit le s težavo prerine skozi endotelij v lokalno tkivo. Te luknje navadno niso zamašene s trombociti. Pri mehanizmu "per rhexis", pa so luknje oz. presledki med posameznimi endotelialnimi celicami tako povečane, da eritrociti zlahka uidejo v lokalno tkivo, v presledkih pa pogosto nastanejo čepi, ki jih sestavljajo trombociti, včasih pa tudi fibrin. Povečani presledki oz. luknje med endotelialnimi celicami naj bi nastali zaradi delovanja hemoraginov na bazalno membrano endotelialnih celic. Na ta način izgine integriteta kapilarnih sten. Hemoragini so lahko za miške letalni že v zelo majhnih dozah, lahko pa sploh niso letalni. Hemoragične toksine vsebujejo poleg kačjih strupov tudi nekateri bakterijski sevi. tak je hemoragičen toksin iz bakterije Vibrio cholerae in kapa-toksin iz bakterije Clostridium perfringens, ki pa sta slabo raziskana.

Dermonekrotični toksini

            Dermonekrotične faktorje (toksine) vsebujejo strupi številnih organizmov. Najdemo jih pri pajkih, meduzah in bakterijah. Dermonekrotični toksini so proteini, ki povzročijo kožne nekroze. Te nekroze pa moramo razlikovati od nekroz, ki so posledica hemoragij, mionekroz in edemov povzročenih s kačjimi toksini. dermonekrotični toksini so večinoma veliki proteini (30-100 kDa), ki se močno razlikujejo v It. Nekateri delujejo encimsko, drugi ne. Večina dermonekrotičnih faktorjev ni popoplnoma očiščenih. Dermonekrotične faktorje iz pajkov so izolirali iz strupnih žlez pajkov roda Loxosceles. Povzročajo nekrotične lezije kože, vendar ne poškodujejo kapilar in mišic v podkožnem in mišičnem sloju. Toksin iz vrste Loxosceles reclusa je bazčen 30 kDa velik protein, ki obstaja v štirih formah (glede na It). Ima sfingomelinazno aktivnost (fosfolipaza D), agregira trombocite, vendar ne deluje proteolitično.

Dermonekrotični dejavniki, ki so jih delno izolirali iz številnih meduz naj bi bili bazični proteini z visokimi mol. masami (okrog 70 kDa). Dermonekrotični faktor iz kubomeduze Chironex fleckeri deluje tako, da odvoji stratum corneum od spodnjega sloja stratum granulozum pri čemer ne prizadene vezivnega tkiva.

 

Toksini, ki vplivajo na strjevanje krvi

            Za fiziološko vlogo krvi je pomembno predvsem to, da je kri tekoča, da pa se pod določenimi pogoji tudi strdi. Na oba procesa delujejo številne naravne snovi, ki pa imajo različne mehanizme in vplivajo na različne dejavnike odgovorne za strjevanje krvi. Preiskus strjevanja ali preprečitve strjevanja delamo vedno "in vitro". Tarča za koagulante ali antikoagulante so lahko membrane ali organeli trombocitov in različni plazemski proteini.

            Za strjevanje krvi so pomembne tri osnovne komponente: žilna stena, trombociti in plazmatski koagulacijski sistem. Pravilna povezanost med temi komponentami omogoča, da pride do strjevanja krvi le takrat, ko pride do poškodbe žilne stene. Napaka ali motnja ene od navedenih komponent nujno privede do motenj in napačnega delovanja drugih dveh.

1. Žilna stena

            Žilna stena ima v homeostazi dvojno vlogo. Ob poškodbi se na mestu poškodbe stena nevrogeno skrči za kakih 20-30 sek, kar omogoči nastanek primarnega čepa iz trombocitov. Poškodba stene pa hkrati aktivira tudi celoten sistem za strjevanje krvi. Poškodovane ali vzdražene celice endotela sproščajo signale, ki reverzibilno aktivirajo trombocite. Če pa je poškodovana tudi bazalna membrana endotelnih celic in pride v stik s krvjo, se trombociti in plazemski proteini odgovorni za strjevanje aktivirajo ireverzibilno. S sprostitvijo tromboplastina se sproži niz posebnih encimskih in bioloških reakcij.

 

2. Trombociti

            Trombociti so majhne brezjederne krvne celice, ki nastajajo iz megakariocit. Človeška kri vsebuje okrog 2-4 x 1011 trombocitov/l krvi. Neaktivirani trombociti imajo ovalno ploščato obliko, ki jim onemogoča pritrditev na žilno steno. Citoplazma trombocitov ima posebne sestavine, ki jih v drugih celicah ne najdemo. Plazmatska membrana se z dolgimi kanali zajeda globoko v citoplazmo. Plazemski proteini se vežejo na t.i. glikokaliks ali zunanji membranski plašč, kjer leže številni receptorji. Srednji sloj membrane predstavljajo fosfolipidi. Od tu se med degranulacijo sprošča fosfolipidni kompleks (faktor 3). Ta sloj je tudi matriks kjer se odvijajo reakcije povezane z faktorji strjevanja in je vir arahnidojske kisline, prekurzorja za nastanek prostaglandinov. V citoplazmi leži v submembranskem delu zapleten preplet mikrotubulov, ki so citoplazmatske cisterne za Ca++ ione. Tu najdemo tudi preplet skrčljivih vlaken, ki jih sestavlja aktomiozinu podoben protein. Ti fibrili so odgovorni za nastanek psevdopodijev med aktivacijo trombocitov, poleg tega pa ta sistem posreduje tudi pri izločanju ADP in drugih aktivnih snovi. V trombocitih ločimo tudi tri tipe granul in sicer:

- granule z veliko gostoto, ki vsebujejo serotonin, K+, ATP, ADP in Ca++.

- a -granule, ki vsebujejo heparinski kofaktor (faktor 4) in druge heparinske inhibitorje, a -tromboglobulin in bazični protein z močno mitogeno aktivnostjo (trombocitni rastni faktor).

Za te granule je specifičen tudi protein trombospondin, ki se prilepi na trombocitno membrano, kjer formira kompleks z fibrinogenom in olajša agregacijo. a -granule vsebujejo tudi številne encime.

- lizosomatske granule, ki jih lahko ugotovimo le z histokemijskimi metodami, vsebujejo veliko encimov, od tu pa se sproščajo tudi kateholamini in glikoproteini

Nekateri plazmatski proteini se adsorbirajo na površino trombocitov. Fibrinogen, von Willenbrandov faktor (vWF) in faktor XIII se sintetizirajo že v megakariocitah. Faktor XII, antitripsin, makroglobulin, antiplazmin in fibronektin, protein, ki prilepi trombocite na ekstracelularno podlago. Energija, ki jo vsi ti procesi potrebujejo, nastaja pretežno z glikolizo.

Trombociti bliskovito reagirajo na spremembe v žilni steni. Prvi signal je sprememba v naboju endotelnih membran iz negativnega v pozitivni naboj. Trombociti se v delčku sekunde reverzibilno vežejo na žilno steno. Pri tej vezavi je udeležen le glikokaliks in ni potrebna energija. Kemični aktivatorji pritrditve in agregacije so ADP, trombin, kateholamini in kolagen. V kolikor je začetni signal dovolj močan, se iz citoplazme trombocitov sprosti ADP. Ta sproži drugo, ireverzibilno fazo pritrditve in agregacije. Tu pride do spremembe površine trombocitov, kar olajša pritrditev trombocitov na žilno steno. Na površini aktiviranega trombocita je kar 2 x 105 specifičnih receptorjev za ADP. Trombin se veže na več receptorje, ki jih predstavljajo faktor V, fibrinogen in aktomiozin. ADP in trombin imata tudi skupne receptorje glikoprotein II in III, ki ležita v membrani in se izpostavita šele ob sproščanju ADP iz citoplazme. Pritrditev trombocitov, ki jo sprožijo ADP, trombin in kateholamini je od Ca++ odvisen proces. Sproščanje Ca++ nadzoruje kalmodulin, protein z majhno mol. m., ki ga izločajo trombociti. Kadar nastane večja poškodba žile, je glavni faktor, ki aktivira trombocite, kolagen. Kolagen se veže na površino trombocitov s posredovanjem vW faktorja, ki lahko pozroči tudi prilepljanje trombocitov na aktivno površino (npr. stekelene kroglice). Pritrditev trombocitov, ki jo sproži kolagen je od Ca++ neodvisen proces, vendar pa zahteva dva glikoproteinska receptorja Ia in Ib. V poskusih "in vitro" lahko kolagen nadomestimo z antibiotikom ristocetinom. Ta povzroči agregacijo trombocitov normalne krvi, tako da veže vW faktor na površino sosednjih trombocitov, ki nato agregirajo.

3. Plazemski sistem

            Plazemski sistem vsebuje 16 faktorjev. Strjevanje krvi najlažje opišemo s kaskadno vrsto, v katero se postopoma vključujejo posamezni faktorji. Glede na vlogo, ki jo imajo posamezni dejavniki v procesu strjevanja krvi, jih ločimo na dve skupini:

a. zimogeni, ki se aktivirajo po podobnih obrazcih kot velja za večino encimskih procesov. V to skupino spadajo serinske proteaze (faktor II, VII, IX, X, XI, XII, protein C in kalikrenoinogen)

b. pospeševalni encimi, ki sami ne sodelujejo v proteolizi, vendar olajšujejo delovanje zimogenov. V to skupino spadajo faktor V, VIII in visokomolekularni kininogen.

Protrombin, faktor VII, IX in X tvorijo t.i. protrombinski kompleks. vsem štirim molekulam je skupno to, da vsebujejo nekaj karboksiliranih glutaminskih kislin. Karboksilacija le-teh pa je odvisna od vitamina K. Vsi našteti faktorji so v plazmi v svoji neaktivni obliki. Do njihove aktivacije pride na različne načine, nekateri od njih predstavljajo posebnost v encimologiji. Aktivacija je sestavljena iz treh stopenj:

1. delna proteoliza, del molekule se odcepi, pri čemer se odkrije aktivni center

2. aktivacija brez proteolize. Tak način zasledimo samo pri nekaterih proteinih udeleženih pri strjevanju krvi. Do tega pride pri pritrditvi na aktivno površino ali vsled encimske aktivnosti, ki pa ne odcepi dela molekule, pač pa le odkrije aktivni center vsled spremembe konformacije.

3. ojačitev encimske aktivnosti s pospeševalnimi faktorji, ki na določeno mesto pritegnejo več potrebnih encimov in tako povečajo njihovo efektivno lokalno koncentracijo.

Na vsakega od omenjenih procesov in sistemov delujejo različni toksini.

Toksini, ki vplivajo na različne procese pri strjevanju krvi

            Večino teh toksinov najdemo pri kačah iz družin Viperidae in Crotalidae, v manjši meri pa tudi pri nekaterih drugih organizmih. V grobem jih delimo na:

-toksine, ki vplivajo na endotelialne celice

-toksine, ki delujejo na trombocite

-toksine, ki vplivajo na kontaktno fazo strjevanja krvi

-toksine, ki vplivajo na endogene in eksogene aktivatorje protrombina

-toksine, ki vplivajo na fibrinogen

-toksine, ki vplivajo na protein C

-toksine, ki vplivajo na antitrombin III

1. toksini, ki vplivajo na celice endotelija

            Primer takega toksina je trombocitin. Izolirali so ga iz strupa kače Bothrops atrox. Je serinska proteinaza, ki povzroča agregacijo trombocitov. V to skupino ta toksin prištevamo zato, ker stimulira sproščanja prostaglandinov I2 iz endotelnih celic popkovnice. Iz podvrste iste kače pa so izolirali batroxobin, ki je prav tako serinska proteinaza. Iz tkiva sprošča aktivator plasminogena. Strup nekaterih klopotač (rod Crotalus) pa sprošča sam plasminogen iz številnih krvnih celic.

2. toksini, ki vplivajo direktno na trombocite

            Številni kačji strupi vplivajo direktno na trombocite. Agregacija trombocitov, sproščanje raznih dejavnikov in preprečevanje tvorbe krvnih strdkov so učinki, ki jih povzročajo zlasti razni toksini kačjih strupov iz družine Viperidae. Ti toksini imajo lahko encimsko ali neencimsko delovanje. Zlasti strup južnoameriških kač iz rodu Bothrops vsebuje številne neencimske toksine, ki inducirajo zlepljanje in agregacijo trombocitov. Take toksine najdemo tudi pri nekaterih elapidnih kačah, zlasti pri mambah. Ti toksini so glikoproteini ali lektini.

3. toksini, ki vplivajo na začetno kontaktno fazo agregacije

            Čeprav o mehanizmu inhibicije agregacije trombocitov v začetni kontaktni fazi tega procesa ne vemo dosti, pa je dejstvo, da številni kačji strupi vsebujejo proteinaze kalikreinskega tipa, ki lahko vplivajo na kontaktno fazo z aktivacijo faktorja XII.

4. toksini, ki vplivajo na eksogene in endogene dejavnike aktivacije protrombina

            Ti toksini so številni, skoraj vsi pa imajo proteolitsko aktivnost in vplivajo na določene faktorje pomembne pri strjevanju krvi. Na splošno ti strupi aktivacijo protrombina pospešujejo, vendar so pri tem odvisni ali pa neodvisni od številnih dejavnikov, zato jih delimo na tri osnovne tipe.

            Aktivnost aktivatorjev tipa 1 ni odvisna od neencimskih kofaktorjev (npr, fVa in fosfolipidov) protrombinskega kompleksa, ki konvertira protrombin v encimsko aktivni meizotrombin. Najbolj znan aktivator tega procesa je ecarin iz južnoameriške kače Echis carinatus. Podobne aktivatorje vsebujejo tudi strupi kač iz rodu Bothrops, Trimeresurus in strupi opistoglifnih "polstrupenih" gožev.

            Aktivatorji tipa 2 so sestavni del kač iz rodu Notechis in drugih elapidnih avstralskih kač. Aktivnost teh toksinov se močno ojača ob dodatku fosfolipidov in Ca++ ionov ter faktorja V. Po aktivnosti močno spominjajo na faktor Xa.

            Tretji tip protrombinskih aktivatorjev predstavljajo toksini v strupu avstralskih tajpanov in rjavic (Oxyuranus sp. in Pseudonaja sp.), ki so odvisni le od fosfolipidov in kalcija ne pa tudi od faktorja V.

            Poleg aktivatorjev protrombinskega kompleksa obstajajo tudi kačji toksini, ki delujejo kot zaviralci aktivacije. Ti toksini cepijo peptidne vezi v protrombinu, kar vodi k nastanku neaktivnih protrombinskih peptidov.

5. toksini, ki vplivajo na fibrinogen

            Te toksine najdemo predvsem v strupu gadov (Viperidae). V glavnem so serinske proteinaze, ki konvertirajo fibrinogen v fibrin tako da odcepijo fibrinopeptide. Ker to delovanje spominja na delovanje trombina, te toksine pogosto imenujemo trombinu-podobni kačji encimi. Znani sta dve a.k. sekvenci teh toksinov -že omenjenega batroksobina iz j. ameriške kače Bothrops atrox moojeni in flavoksobina iz azijske jamničarke Trimeresurus flavoviridis. Glede na sekvenco kot tudi na organizacijo genov lahko toksina primerjamo s serinskimi proteinazami tipa tripsin-kalikrein. Toksini iz različnih vrst kač cepijo fibrinogen na različnih mestih in odcepljajo različne peptide. Kljub temu pa vse kačje trombinske proteinaze kažejo skupne lastnosti, kot je npr. neobčutljivost na naravne trombinske inhibitorje. Poleg trombinu podobnih proteinaz vsebujejo kačji strupi tudi druge proteolitske encime, ki cepijo fibrinogen, ki pa niso sorodne trombinu. Glede na to, katero verigo cepijo ločimo fibrinogenaze A in B.

Če ti toksini povzročajo formiranje krvnih strdkov, pa jih drugi toksini zavirajo. Ti toksini so t.i dizintegrini, ki so po delovanju podobni hirudinu. Najdemo jih pri številnih kačah tako pri gadih kot strupenih gožih. So polipeptidi, ki jih sestavlja okrog 80 a.k. Njihova skupna lastnost je značilen motiv zaporedja treh a.k. arginina, glicina in asparaginske k., zato jih imenujemo tudi RGD proteini. Ta motiv je namreč odločilen pri vezavi fibrinogena na fibrinogenske receptorje na membrani trombocitov. Dizintegrini delujejo torej tako, da preprečijo vezavo fibrinogena na receptor in tako onemogočijo agregacijo trombocitov.

 

Toksini, ki delujejo na citoskelet

            Toksinom, ki jih bomo obravnavali je skupno to, da delujejo na citoskelet sesalskih celic. Med temi toksini so taki, ki na nekatere dele citoskeleta delujejo neposredno in specifično in taki, katerih mehanizem delovanja ni popolnoma pojasnjen in je verjetno učinek na citoskelet le prva faza njihovega delovanja.

            Citoskeletni toksini so strukturno zelo različne snovi, najdemo pa jih pri številnih in večkrat popolnoma nesorodnih organizmih. Citoskeletni toksini so lahko tudi številni sintetični toksikanti, večino pravih naravnih citotoksinov pa so izolirali iz bakterij, gliv, spužev in rastlin. Citotoksini so lahko proteini, ciklični peptidi, alkaloidi, makrolidi, benzimadazolni derivati itd. Citoskeletne toksine lahko razdelimo glede na tarčno mesto, ki ga prizadenejo. Tako ločimo:

- toksine, ki delujejo na mikrotubule

- toksine, ki delujejo na mikrofilamente

- toksine, ki delujejo na intermediane filamente

Osnovne značilnosti citoskeleta

            Citoplazma celic ni zgolj nekakšna proteinska juha, v kateri plavajo organeli, pač pa ima tudi citoskelet, ki ji daje obliko. Citoskelet ima pomen tudi pri gibanju, citokinezi, mitozi, intracelurarnem transportu, endocitozi, eksocitozi in pri komunikaciji med posameznimi celicami. Izraz citoskelet pravzaprav ni najbolj posrečen, saj citoskelet ni neka rigidna struktura, pač pa hitro se spreminjajoč in fleksibilen splet citoskeletnih elementov. Ti skeletni elementi so mikrotubuli, mikrofilamenti in intermediani mikrofilamenti.

            Mikrotubuli so polimeri 110 kDa velikega proteina tubulina, ki ga sestavljata a in b podenota. Za nastanek mikrotubulov, ki so sestavljeni iz 11-16 (najpogosteje 13) protofilamentov (verig tubulina) so "in vitro" potrebni Mg++, GTP, posebni protein MAP, ki je povezan z mikrotubuli, in nekoliko povečana temperatura. Ca++ že v mikromolarnih konc. inhibira nastanek mikrotubulov oz. povzroči razpad nastalih mikrotubulov, enako pa se zgodi tudi pri nizki temperaturi, povišanemu pritisku in ob dodatku številnih toksinov. Ne vemo pa ali v celicah poteka nastanek mikrotubulov na enak način kot in vitro.

            Mikrofilamenti so drugi element citoskeleta. So polimeri aktina, proteina, ki v evkariotskih celicah predstavlja kar 5-10% totalnega proteina. Globularni G-aktin obstaja v celici v dinamičnem ravnotežju s polimernim F-aktinom. G-aktin (razen v mišicah) je monomer z velikostjo 41.8 kDa. Povezava aktinskih filamentov zahteva in vitro navzočnost 3-4 molekul G-aktina, ATP, Mg++ in Ca++ ione. Filamenti imajo zgradbo dvojne v desno zavite vijačnice, katere premer je 6-8 nm. Filament ima zašiljen konec in razvejan (bodičast) konec. Slednji se podaljšuje hitreje. ATP je vezan na G-aktin, ob hidrolizi ATP pa G-aktinske molekule polimerizirajo v F-aktin. Na filamente sta vezana tako ADP kot tudi anorganski fosfat. Šele ko se slednji sprosti, filamenti razpadejo. Mikrofilamenti so v celicah v obliki mrežnih prepletov oz. v obliki bolj ali manj prepletenih snopov. Organizacija mikrofilamentov je odvisna od tipa celice. V nekaterih celicah je polarizacija orientacije filamentov večja, v drugih manjša. V celicah najdemo vsaj 10 proteinov, ki vežejo aktinske mikrofilamente. Med njimi je najbolj znan eritrocitni protein spektrin, ki ga najdemo tudi v nekaterih drugih celicah. Njegova naloga je, da veže aktinske filamente na membrane.

            Intermediani filamenti so tretji element citoskeleta. Njihova natančna biološka vloga ni pojasnjena, čeprav kar dosti vemo o njihovi zgradbi. Intermediani filamenti so gladka vlakna, ki merijo v premeru 10-15 nm. Sestavljeni so iz enakih vlaken, ta pa so vsa iz 3 nm debelih protofilamentov ovitih drug okrog drugega. V fizioloških razmerah so ti filamenti v nasprotju z mikrotubuli in mikrofilamenti zelo stabilne strukture. In vitro so stabilni v širokem območju ionskih jakosti, niso topni v neionskih detergentih. Da razpadejo jih moramo denaturirati z nizkimi ali visokimi pH vrednostmi. V celicah kot monomeri verjetno sploh ne obstajajo. Razlikujemo pet različnih podtipov intermedianih filamentov, vsak od njih je značilen za določen tip celic. Proteini, ki sestavljajo intermediane filamente, se imenujejo citokeratini. Poznamo 25-30 citokeratinov, ki se različno ekspresirajo v različnih epitelnih celicah in tkivih. Vsi proteini, ki sestavljajo intermediane filamente, imajo nekaj mest, kjer poteče fosforilacija. Ta mesta so večinoma skoncentrirana na C-terminalnem delu posamezne molekule. Fosforilacijo sprožijo od cAMP odvisne kinaze, čeprav nam sama fosforilacija ne da zadovoljivega odgovora o njeni vlogi pri nastanku filamentov. Ker za nastanek le-teh kot tudi za njihov razpad niso potrebni ioni, kofaktorji in vezavni proteini, lahko sklepamo, da je za te procese bistvena le stopnja fosforilacije.

Toksini, ki delujejo na mikrotubule

            Danes poznamo okrog 20 naravnih snovi, ki vplivajo na mikrotubularni skelet. V glavnem so to rastlinski alkaloidi. Večina od teh snovi se veže z veliko specifičnostjo na tubulin. Toksini preprečijo nastanek mikrotubulov ali pa nastanek mikrotubulov močno pospešijo. Prizadete celice kažejo različne citološke spremembe, končni efekt pa je vedno inhibicija normalne celične delitve. Toksini namreč vplivajo na nastanek delitvenega vretena. Nekatere toksine zato uporabljajo kot kemoterapevtike v onkologiji, čeprav povzročajo podobne stranske učinke kot citostatiki.

Kolhicin

            Kolhicin je najbolj znan alkaloid jesenskega podleska (Colchicum autumnale). Že leta 1930 so ga opisali kot strup, ki prizadene nastanek delitvenega vretena in inhibira metafazo. Kolhicin je bil prvi toksin, za katerega so dokazali, da se veže na tubulin. Glavni patološki simptomi povezani z zastrupitvami s kolhicinom so motnje v krvni sliki, driska in druge prebavne motnje. To je posledica motenj v delitvi epitelnih celic črevesne sluznice. Do sprememb lahko pride tudi v mišicah, živčevju in jetrih. Ker je kolhicin močno toksičen, razpolovni čas v organizmu pa dolg, kolhicin ne uporabljajo kot kemoterapevtik.

            Kolhicin je alkaloid s tremi obroči, najbolj značilen je tropolonski obroč s sedmimi C-atomi. Kolhicin se veže z veliko afiniteto na tubulinski dimer v molarnem razmerju 1:1. Vezava kolhicina je počasna, a jo težko preprečimo. Ko je vezan na tubulin, se nastanek mikrotubulov popolnoma zaustavi. Poleg direktnega vpliva na nastanek mikrotubulov, kolhicin poveča tudi število intermedianih filamentov, vse skupaj pa onemogoči celično delitev.

Taksol

            Taksol so prvič izolirali iz kalifornijske tise (Taxus brevifolia) leta 1971 in je danes eno najbolj obetavnih naravnih kemoterapevtskih sredstev za zdravljenje nekaterih rakastih obolenj. Taksol je strupen, če ga vnesemo po i.p. ali i.v. poti, vendar je njegova toksičnost razmeroma majhna (128 mg/kg miši). Taksol je zelo maočan inhibitor celične delitve in ima izrazito protitumorsko delovanje. Taksol je zapletena organska molekula estrskega tipa, derivat taksana z oksetanskim obročem in je zelo slabo topen v vodnih raztopinah. V nasprotju z drugimi toksini, ki delujejo na mikrotubule tako, da preprečijo njihov nastanek, jih taksol stabilizira. Z veliko specifičnostjo se ireverzibilno veže na že formirane mikrotubule. To povzroči premik v ravnotežju med tubulinom in polimeri v prid slednjih. Mikrotubuli nastanejo ob dodatku taksola tudi če v sistemu ni GTP in MAP proteinov in tudi pri nizkih temeperaturah. Mikrotubuli z vezanim taksolom ne razpadejo in niso občutljivi na Ca++. Snopi mikrotubulov, ki nastanejo zaradi vpliva taksola, so vedno vezani na endoplazmatski retikulum. Ti snopi pa nastanejo le v nepoškodovanih celicah z normalnim nivojem ATP. Celice s takimi snopi ostanejo žive in tako sintetizirajo makromolekule celo pri zelo visokih koncentracijah taksola, ki pa v vsakem primeru popolnoma blokira celično delitev. Taksol vpliva predvsem na mikrotubule delitvenega vretena, ki so očitno najbolj občutljivi, saj pri normalni delitvi zelo hitro nastanejo in tudi hitro razpadejo. Taksol oz. njegovi vodotopni umetni analogi in derivati se že uporabljajo za zdravljenje karcinoma dojke in raka na jajčnikih.

Toksini, ki delujejo na mikrofilamentni sistem

            Številni toksini, ki so jih izolirali iz različnih organizmov in se kemično ločijo, delujejo na mikrofilamentni sistem celičnega ogrodja. Načini njihovega delovanja so zapleteni kot je zapleten sam mikrofilamentni sistem. Toksine, ki se vežejo direktno na mikrofilamente lahko razdelimo na:

- toksine, ki preprečijo polimerizacijo aktina in pospešijo razpad mikrofilamentov

- toksine, ki pospešijo polimerizacijo aktina in stabilizirajo polimere

- encimsko aktivne encime, ki prenesejo ribozo iz NAD+ na aktin

Značilni predstavniki prve skupine so citohalasini, druge falotoksini in tretje klostridijski C2 toksin.

Citohalasini

            Citohalasini so naravni proizvod nekaterih plesni. Prvega predstavnika teh toksinov so izolirali iz hipomicetne glive Helminhosporium dermatioideum. Akutna toksičnost za glodalce je med 1-5 mg/kg. Podgane, ki so prejele letalno dozo citohalasina E so poginile po 18 urah. Glavni simptomi so bili kopičenje tekočine v peritonealni votlini ter degenerativne spremembe številnih tkiv. Izvor besede citohalasin je grškega izvora in v dobesednem prevodu pomeni celično relaksacijo. Citohalasini dejansko "sproste" citoplazmo. Blokirajo citokinezo, medtem ko ostane jedrna delitev neprizadeta. Posledica je torej nastanek večjedrnih celic. Citohalasini se in vitro vežejo na F-aktin in sicer na hitro rastoči del filamenta. Vezava citohalasina verjetno blokira ta del rastočega filamenta in tako zmanjša hitrost povezav. Citohalasin B povzroči razpad aktinskih gelov, vendar se na sam G-aktin ne veže. Citohalasin D se veže v molarnem razmerju 1:1 tudi na prosti G-aktin.

            Na celičnem nivoju se delovanje citohalasinov kaže v obsežni dezorganizaciji mikrofilamentnega sistema. Ta učinek se pojavi 10 do 30 min po dodatku citohalasinov, vendar pa je reverzibilen, saj po odstranitvi toksinov iz ekstracelularnega medija takoj izgine. Mikroskopska slika nam pokaže skrčene in nagubane celice z dolgimi filamentoznimi izrastki. Ta učinek naj bi bil povezan z razpoložljivo energijo in ga imenujemo hiperkontrakcija mikrofilamentnega sistema.

 

Falotoksini

            Falotoksini so biciklični heptapeptidi, ki jih najdemo v smrtno strupeni zeleni mušnici (Amanita phalloides) in sorodnih vrstah A. verna in A. virosa. Slednja proizvaja tudi zelo sorodne virotoksine. Ti so monociklični heptapeptidi. Skupna lastnost obeh toksinov je stabilizacija F-aktinskih filamentov in preprečitev njihove razgradnje. Falotoksini so toksični oralno in jih ne moremo uničiti s kuhanjem. Najbolj znan predstavnih falotoksinov je faloidin. Deluje na jetrne celice. Faloidin se in vitro v ekvimolarnem razmerju trdno veže na F-aktin. Tako stabilizira F-aktinske filamente in jih zaščiti pred delovanjem drugih toksinov, ki te filamente destabilizirajo. Prav tako onemogoči razgradnjo tistim agensom, ki normalno povzročijo razgradnjo F-aktinskih filamentov (npr. haotropni ioni, DNAze, =.6 M KI, visoka temperatura, nizek pH, proteaze, sonifikacija itd.). Kompleks F-aktina s faloidinom še lahko veže težko verigo meromiozina. Natančen mehanizem stabilizacije F-aktinskih filamentov s faloidinom ni znan. Falotoksini se vežejo na F-aktin nekovalentno, a z zelo veliko afiniteto (Kd okrog 10-8 M). Nikoli se ne vežejo na G-aktin. Oralna LD50 za faloidin je okrog 2 mg/kg telesne teže. Faloidin selektivno in ireverzibilno poškoduje jetra. Hepatocite z aktivnim transportom prevzemajo falotoksine iz krvi. Transporter je normalno verjetno odgovoren za transport žolčnih kislin. 10-50 m g faloidina povzroči v kulturi hepatocit že po dveh urah mehurčaste in štrleče izrastke jetrnih celic. Višje konc. povzročijo enake učinke že po 10 min. Učinki faloidina so vsaj in vitro odvisni od Ca++.

Bakterijski proteinski citotoksini

            Za razliko od drugih citotoksinov so bakterijski citotoksini proteini. Delujejo tako, da uničijo mikrofilamente. Natančnih molekularnih mehanizmov delovanja teh toksinov še ne poznamo. Proteinski citotoksini so večinoma produkt bakterij iz rodu Clostridium. Nekateri klostridijski toksini delujejo z ADP-ribozilacijo G-aktina in tako preprečijo njegovo polimerizacijo, torej delujejo direktno, drugi pa na indirektni način.

C. botulinum C2 toksin

            Določeni sevi bakterije C. botulinum proizvajajo citotoksičen enterotoksin, ki ni enak bolj znanemu nevrotoksinu (C1). C2 je sestavljen iz dveh ločenih polipeptidov (55 in 105 kDa). V razstopini polipeptida nista povezana in vsak zase nimata aktivnosti. Večji polipeptid lahko aktiviramo s tripsinom in dobimo 88 kDa velik fragment. Tak polipeptid očitno olajša vezavo toksičnega manjšega polipeptida na vezavno mesto. Ta toksin ima ADP-ribozilazno aktivnost in direktno ribozilira G-aktin, vendar ne tudi aktin v mišičnih celicah oz. že polimerizirani F-aktin. Riboziliran G-aktin ne more polimerizirati tudi če mu dodamo faloidin lahko pa veže DNAzo I.

            Toksin C2 je toksičen za številne celice. Povzroča od doze odvisno zaobljenost celic, ki se navadno pojavi 1-2 uri po dodatku toksina v celično kulturo. Celice čez 24-48 ur propadejo. Toksin vpliva predvsem na epitelne celice prebavnega trakta. Toksina s podobno aktivnostjo kot jo ima C2 toksin sta prav tako klostridijska toksina C. perfingens iota toksin in C. spiroforme iota podoben toksin. Iota toksin se od C2 toksina razlikuje po tem, da lahko ribozilira tudi aktin skeletnih mišic. Riboziliran skeletni G-aktin lahko deluje kot aktinski cap protein, ki se veže na bodeči konec aktinskih filamentov kar povzroči njihov razpad.

Toksini iz bakterije Clostridium difficile

            Ta bakterija proizvaja vsaj dva toksična proteina, toksin A in toksin B. Toksin A je šibko toksičen enterotoksin, toksin B pa je močno citotoksičen, vendar ne tudi enterotoksičen. Oba toksina sta letalna in vpletena v patogenezo membranoznega kolitisa, ki je povezan s prekomernim zdravljenjem nekaterih drugih obolenj z antibiotiki. In vitro toksina ne kažeta encimske aktivnosti, nimata ne proteazne ne fosfolipazne pa tudi ne ADP-ribozilazne aktivnosti.

            Na celičnem nivoju deluje toksin B približno 1000 krat močneje kot toksin A, čeprav v učinku med obema toksinoma ni opaznih razlik. Toksina delujeta ireverzibilno, čeprav imata podoben učinek kot citohalasin B. Učinki so vidni že po 45 min, da pride toksin v stik s celicami pa je potrebnih le 30 sek. Toksin B povzroči razsulo v organizaciji mikrofilamentov. G-aktin se zbere okrog jedra. Z elektronskim mikroskopom se lepo vidi da mikrofilamenti razpadejo preden so vidne druge poškodbe. Toksin B povzroča tudi nastanek večjedrnih celic, ker očitno prepreči citokinezo. Tudi toksin A, čeprav v manjši meri, povzroča spremembe v citoskeletu. Aktivnost toksinov iz C. difficile je povezana z intracelularnim preoblikovanjem.

Toksini cianobakterij

            Cianobakterije (včasih modrozelene alge), ki jih uvrščamov v rodove Microcystis, Nodularia, Oscillatoria in Anabaena proizvajajo sorodne peptidne toksine, ki vplivajo na celične mikrofilamente. Ti toksini lahko povzročijo bolezenska znamenja pa tudi smrt domačih in divjih živali, ki pijejo okuženo vodo. Znani so tudi primeri zastrupitev pri ljudeh. Ti peptidi so hepatotoksični toksini, katerih delovanje spominja na falotoksine. V poskusnih živalih povzročijo obsežne hemoragije jetrnega tkiva in porušijo celotno arhitekturo jeter. Toksini naj bi se transportirali v jetra z istimi transportnimi sistemi kot žolčne kisline, torej zopet podobno kot falotoksini. Povprečna LD50 za toksine iz cianobakterij rodov Microcystis in Nodularia je okrog 45 m g/kg miši, medtem ko so toksini iz drugih dveh rodov nekoliko manj toksični. Cianobakterija Microcystis aeruginosa proizvaja več različnih toksičnih heptapeptidov, ki jih imenujemo mikrocistini. Osnovna struktura mikrocistinov je

ciklo-D-Ala-L-X-eritro-b -metil-D-izoAsp-L-Y-Adda-D-izoGlu-N-metil-dehidro-Ala.

Pomembna je predvsem Adda, ki je nenavadna b -aminokislina (3-amino-9-metoksi-2,6,8-trimetil-10-fenildeka-4,6-dienoična kislina. Aminokislina označena z X je lahko levcin (L), arginin (R) ali tirozin (Y), aminokislina Y pa je lahko arginin (R), alanin (A) ali metionin (M). Po teh aminokislinah tudi označujemo različne mikrocistine (LR, LA, YA, YM, YR in RR). Za razliko od mikrocistinov so nodularini pentapeptidi, ki pa povzročajo zelo podobne učinke.

            Raziskave z mikrocistini so pokazale, da na izoliranih jetrih povzročajo vezikulacijo grobega endoplazmatskega retikuluma, nabrekanje mitohondrijev, pojavijo se velike citoplazmatske vakuole, prizadeti pa so tudi žolčni vodi. Podobne učinke opazimo tudi "in vivo". Mikrocistini in njim sorodni toksini povzročajo pojav mehurčastih struktur na površini hepatocit, kar vodi k spremembi celotne morfologije jetrnega tkiva. Po 20 minutah delovanja mikrocistinov (m g doze) celice izgube vse mikrovile, v citoplazmi pa pride do agregacije aktinskih polimerov, kar povzroči prerazporeditev celičnih organelov. Ti procesi so neodvisni od Ca++ in glutationa. Intoksikacijo ne preprečijo reducenti pa tudi ne inhibitorji intracelularnih proteinaz in fosfolipaz. Danes velja, da so mikrocistini in drugi toksini cianobakterij pravzaprav močni inhibitorji jetrnih fosfataz, te pa so med drugim pomembne za pravilno delovanje mikrofilamentnega sistema. Vpliv na mikrofilamente je torej le posledica delovanja mikrocistinov na celične fosfataze. Sami mikrocistini imajo le omejen vpliv na polimerizacijo aktinskih filamentov, če pa jih uporabimo skupaj s citohalasini se delno spremeni celično razmerje med G- in F-aktinom. Mikrocistin verjetno vpliva na samo polimerizacijo ne vpliva pa na depolimerizacijo aktinskih mikrofilamentov. Niti mikrocistini niti citohalasini pa ne morejo preprečiti popolne polimerizacije aktinskih filamentov s faloidinom.

Latrunkulini

            So snovi, ki so jih izolirali iz rdečemorske spužve Latrunculia magnifolia. Latrunkulin A in latrunkulin B sta makrolida. Submikromolarne konc. latrunkulinov (med 35-150 ng) povzročijo obsežne spremembe v organizaciji mikrofilamentov v mišjih fibroblastih in nevroblastih. Površina prizadetih celic postane nagubana, citoplazma pa se zbere okrog jedra. Latrunkulini preprečijo aktinsko polimerizacijo, verjetno pa ne vplivajo na že formirane aktinske polimere. Delovanje latrunkulinov je reverzibilno, kar je podobno delovanju citohalasinov.

Toksini, ki vplivajo na intermediane filamente

            Poznamo le nekaj snovi, ki vplivajo na intermediane filamente. Večinoma so to toksikanti in ne toksini, torej sintetične snovi. V to skupino uvrščamo snovi, kot so 2,5 heksandion, akrilamid in trietil svinčevklorid. Med naravnimi snovmi je znanih le nekaj bakterijskih toksinov, ki vplivajo direktno na intermediane filamente. To so toksin davice (Diphteria), eksotoksina A in eksoencim S iz bakterije Pseudomonas aeruginosa ter epidermolitični faktor iz bakterije Staphylococcus aureus.

            Toksin davice v prvi vrsti deluje kot inhibitor elongacijskega faktorja 2 pri evkariontski proteinski sintezi. Nekaj ur po inhibiciji sinteze pride do razpada vimentinskih filamentov, ne da bi bili prizadeti mikrotubuli ali mikrofilamenti. Tudi toksina iz Psudomonas aeruginosa naj bi delovala tako, da razbijeta vimentinske filamente, monomerni vimentin pa nato služi kot substrat, ki ga toksin ADP-ribozilira.

            Epidermolitični faktor iz bakterije S. aureus pa deluje nekoliko drugače. Ta toksin povzroča razslojevanje kože, pri čemer se celice v stratum granulozum ločijo, nastane prazen intradermalni prostor, okolišnje tkivo pa ostane normalno. Toksin se veže na filagrin, to pa je eden izmed pridruženih proteinov intermedianih filamentov. Toksin se prilepi na keratohialinske granule. Ti organeli so specifični za epidermalni kožni sloj, ki ga sestavlja nepravilna mreža keratinskih intermedianih filamentov, poleg teh pa tudi filagrin. Filagrin lahko izoliramo iz stratum corneum humane povrhnice. Filagrin ni nikoli povezan z mikrotubuli ali mikrofilamenti, pač pa se vsaj in vitro povezuje z intermedianimi filamenti raznih celic, zaradi česar nastanejo dolga vzporedno potekajoča vlakna. Filagrin lahko vzpodbudi nastanek takih makrofibril le po proteolitskem razcepu in vivo. To se zgodi takrat, ko se granularne celice spremenijo v stratum corneum, v teh pa ima filagrin vlogo interfilamentoznega matriksa, preko katerega nastane netopni in značilni proteinski kompleks povrhnjice - keratin. Epidermolitični toksin verjetno deluje prav na nastanek keratinskega kompleksa, čeprav natančen mehanizem delovanja ni znan.