|
Raziskovalno delo na katedri je usmerjeno v raziskovanje biološko aktivnih snovi iz morskih organizmov. Tehnike, ki jih uporabljamo pokrivajo cel spekter biokemijskih preparativnih in analitskih metod (HPLC, nizkotlačna kromatografija, spektrofotometrija, fluorimetrija, testi na mikročitalcu, SDS-PAGE) in molekularnobioloških metod. Del metod je posebej usmerjen v študij interakcij proteinov z lipidnimi membranami (površinska plazmonska resonanca, monosloji). V okviru katedre deluje Infrastrukturni center za površinsko plazmonsko resonanco. Področja s katerimi se ukvarjamo (glej tudi SICRIS):
Struktura-funkcija citolitičnih proteinov iz morskih vetrnic ► Citolitični protein iz bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus) ► Karakterizacija farmakološko aktivnih snovi iz morskih organizmov ► |
|
Pri svojem delu sodelujemo z naslednjimi raziskovalci in skupinami:
|
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
V strupu morskih vetrnic najdemo več farmakološko aktivnih snovi. Skupina proteinov, ki tvorijo pore, imenujemo aktinoporini. So zelo močni toksini z vrsto farmakoloških efektov. Najbolj proučena je tvorba pore v naravnih in modelnih lipidnih membranah. Aktinoporine druži skupen mehanizem delovanja, ki poteka v več stopnjah (zgornja slika): vezava topnega monomera na membrano, oligomerizacija, vgradnja v membrano in oligomerizacija v končno poro, ki je prepustna za majhne molekule. V naši skupini proučujemo ekvinatoksin II, izoliran iz konjske morske vetrnice Actinia equina. V zadnjih letih poskušamo razumeti interakcijo ekvinatoksina z membranami na molekularnem nivoju. Predvsem nas zanima topologija membransko vezanega toksina in kateri deli sodelujejo pri vezavi in oligomerizaciji. |
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
Pregledni članki: Maček P (1992): Polypeptide cytolytic toxins from sea anemones (Actiniaria). FEMS Microbiol Immunol. 5(1-3):121-129. Anderluh G, Maček P (2002): Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria). Toxicon 40: 111-124. |
|
(V slovenščini. Pregledni članek o toksinih, ki tvorijo pore) |
|
 3D zgradba ekvinatoksina: Athanasiadis A, Anderluh G, Maček P, Turk D (2001): Crystal Structure of the Soluble Form of Equinatoxin II, a Pore-Forming Toxin from the Sea Anemone Actinia equina. Structure 9:341-346. Hinds MG, Zhang W, Anderluh G, Hansen PE, Norton RS. (2002) Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: implications for pore formation. J Mol Biol. 315(5):1219-29. |
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
Molekularni mehanizem delovanja: Anderluh G, Barlič A, Podlesek Z, Maček P, Pungerčar J, Gubenšek F, Zecchini ML, Serra MD, Menestrina G (1999): Cysteine-scanning mutagenesis of an eukaryotic pore-forming toxin from sea anemone: topology in lipid membranes. Eur J Biochem. 263(1):128-36. Malovrh P, Barlič A, Podlesek Z, Maček P, Menestrina G, Anderluh G (2000): Structure-function studies of tryptophan mutants of equinatoxin II, a sea anemone pore-forming protein. Biochem J. 346:223-32. Hong Q, Gutierrez-Aguirre, Barlič A, Malovrh P, Kristan K, Podlesek Z, Maček P, Turk D, Gonzalez-Manas JM, Lakey JH, Anderluh G (2002): Two-step Membrane Binding by Equinatoxin II, a Pore-forming Toxin from the Sea Anemone, Involves an Exposed Aromatic Cluster and a Flexible Helix. J. Biol. Chem. 277: 41916-41924. |
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
V zadnjih letih potekajo obsežne biokemijske in genetske raziskave usmerjene v proučevanje rasti in razvoja komercialno pomembnih užitnih gob. Iz bukovih ostrigarjev (Pleurotus ostreatus) in njivnic (Agrocybe aegerita) smo izolirali nova proteina ostreolizin in egerolizin. Oba imata molekulsko maso 15 kDa in sta predstavnika egerolizinske družine proteinov (Pfam. Ac.No. PF06355). Ostreolizin in egerolizin se spečificno izražata v času tvorbe primordijev in plodnih teles, ter verjetno imata pomembno vlogo v razvojnem krogu gobe. Ostreolizin je v nanomolarnih koncentracijah litičen za eritrocite in nekatere celične linije, ter toksičen za glodalce (LD50 = 1.17 mg/kg). Na katedri se ukvarjamo s proučevanjem mehanizma nastanka pore ter interakcijami ostreolizina z naravnimi in umetnimi membranami, lipidi in lipidnimi derivati. Ugotovili smo, da se ostreolizin specifično veže na in lizira vezikle v tekoči urejeni fazi, katerih lipidna sestava spominja na sestavo lipidnih raftov. Rafti so membranske domene z vrsto pomembnih bioloških funkcij (signalizacija, transmembranski transport, vezava in vstop toksinov, patogenov in ostalih ligandov). Rezultati naših raziskav na različnih celicah ter na umetnih lipidnih mono- in dvoslojih kažejo na to, da bi fluorescentno označene mutante ostreolizina brez litične aktivnosti lahko bile potencialno uporabne kot markerji za lipidne rafte. |
 |
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
Publikacije: Berne S, Križaj I, Pohleven F, Turk T, Maček P, Sepčić K (2002): Pleurotus and Agrocybe hemolysins, new proteins hypothetically involved in fungal fruiting. Biochim Biophys Acta 1570(3):153-159. Vidic I, Berne S, Drobne D, Maček P, Frangež R, Turk T, Štrus J, Sepčić K (2005): Temporal and spatial expression of ostreolysin during development of the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Mycol Res 109, 377-382. Rebolj K, Poklar Ulrih N, Maček P, Sepčić K (2006): Steroid structural requirements for interaction of ostreolysin, a lipid-raft binding cytolysin, with lipid monolayers and bilayers. Biochim Biophys Acta, Biomembr 1758, 1662-1670. Žužek MC, Maček P, Sepčić K, Cestnik V, Frangež R (2006): Toxic and lethal effects of ostreolysin , a cytolytic protein from edible oyster mushroom (Pleurotus ostreatus), in rodents. Toxicon 48, 264-271. Malicev E, Chowdhury Haque L, Maček P, Sepčić K (2007): Effect of ostreolysin, an Asp-hemolysin isoform, on human chondrocytes and osteoblasts, and possible role of Asp-hemolysin in pathogenesis. Med Mycol, 45(2):123-130. |
 Imunolokalizacija ostreolizina v lističih zrelih plodnih teles bukovega ostrigarja. Ostreolizin smo dokazovali tako, da smo rezine gobe inkubirali prvo s primarnimi protitelesi proti ostreolizinu, potem pa še s sekundarnimi protitelesi, označenimi z rdečim fluorescenčnim barvilom Rodamin (Vidic et al., 2005).
 |
Preplet hif bukovega ostrigarja (Pleurotus ostreatus), posnet z vrstičnim elektronskim mikroskopom, 5000 × povečava. Zaponke (clamp connections) na hifah so označene z rdečimi puščicami. Uporabili smo elektronski žarek z energijo 5 keV in konvencionalni detektor sekundarnih elektronov (Pohleven J., 2005). |
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
Sesilni morski organizmi kot so alge, spužve, ožigalkarji, mahovnjaki in plaščarji, so prave naravne "kemične tovarne", ki producirajo vrsto biološko aktivnih snovi. Te jih varujejo pred plenilci, preprečujejo naseljevanje drugih organizmov na njihovo površino in jim pomagajo v tekmovanju za prostor. Potencialno so uporabne tudi za človeka, npr. v medicini in farmaciji (zdravila) ter v kmetijstvu (insekticidi). V našem laboratoriju redno pregledujemo vodne in organske ekstrakte jadranskih morskih nevretenčarjev na vsebnost biološko aktivnih snovi. V ta namen uporabljamo vrsto bioloških testov (hemoliza, citotoksičnost, hemaglutinacija, antibakterijska aktivnost, inhibicija različnih encimov). Iz vodnega ekstrakta kruhaste spužve (Reniera sarai (Pulitzer-Finali)) smo izolirali polimerne alkilpiridinijeve soli (poly-APS, na sliki), ki kažejo izrazito inhibitorno delovanje na encim acetilholinesterazo, kakor tudi druge učinke (hemoliza, citotoksičnost). Proučevali smo kinetiko inhibicije acetilholinesteraze, ki se konča z ireverzibilno denaturacijo encima. V sodelovanju s skupino iz Genove (Italija) smo ugotovili, da imajo poly-APS tudi močan antivegetativni učinek, saj zavirajo pritrjanje ličink raka vitičnjaka Balanus amphitrite. Pritrjanje mikro- in makroorganizmov (predvsem školjk in rakov vitičnjakov) na podvodne površine predstavlja resen problem v industriji in pomorstvu, saj zmanjšuje hitrost plovil in povzroča škodo na potopljenih objektih. Zaščitni antivegetativni premazi, ki se uporabljajo za reševanje tega problema, vsebujejo večinoma aktivne snovi na osnovi kositra in bakra, ki so žal tudi toksični za različne vodne organizme. Evropska skupnost je že delno omejila uporabo premazov, ki vsebujejo kositer. Vse to je sprožilo raziskave na področju iskanja novih naravnih molekul z antivegetativnim učinkom. Raziskave so usmerjene predvsem v izolacijo takih naravnih snovi, ki imajo močne antivegetativne učinke, a le majhno toksičnost, in so dovolj enostavne, da se jih da pridobivati tudi s organsko sintezo. Rezultati inhibicije pritrjevanja in testi toksičnosti nakazujejo, da so poly-APS take spojine, ki bi jih lahko uporabili v antivegetativnih premazih. Antivegetativno delujejo tako proti mikro- kot tudi proti makroorganizmom, najpomembnejše pa je to, da je njihov mehanizem inhibicije pritrjanja očitno reverzibilen in netoksičen. Vse to opogumlja nadaljnje raziskave tudi v smeri preiskušanja sintetičnih analogov v laboratorijskih poskusih. V sodelovanju s skupino iz Trenta (Italija) smo nedavno uspeli sintetizirati dimerne in tetramerne analoge poly-APS. Pomembno je tudi iskanje tehničnih rešitev vklapljanja poly-APS oziroma sintetičnih analogov v različne premaze ter preverjanje učinkovitosti zaščite premazanih površin v morju. V sodelovanju s skupino iz Aberdeena (Škotska) smo ugotovili tudi, da poly-APS tvorijo prehodne pore v membranah sesalskih celic ter omogočajo njihovo stabilno transfekcijo s plazmidno DNA. Zato bi poly-APS bili lahko potencialno uporabni v genski terapiji. Publikacije: Sepčić K, Guella G, Mancini I, Pietra F, Serra MD, Menestrina G, Tubbs K, Maček P, Turk T (1997): Characterization of anticholinesterase-active 3-alkylpyridinium polymers from the marine sponge Reniera sarai in aqueous solutions. J Nat Prod. 60(10):991-6. Faimali M, Sepčić K, Turk T, Geraci S (2003): Non-toxic antifouling activity of polymeric 3-alkylpyridinium salts from the Mediterranean sponge Reniera sarai (Pulitzer-Finali). Biofouling 19(1): 47-56. Tucker SJ, McClelland D, Jaspars M, Sepčić K, MacEwan DJ, Scott RH (2003): The influence of alkyl pyridinium sponge toxins on membrane properties, cytotoxicity, transfection and protein expression in mammalian cells. Biochim Biophys Acta 1614(2):171-81. Mancini I, Sicurelli A, Guella G, Turk T, Maček P, Sepčić K (2004) Synthesis and bioactivity of linear oligomers related to polymeric alkylpyridinium metabolites from the Mediterranean sponge Reniera sarai. Org Biomol Chem. 2(9):1368-75 |
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
 |
Knidociste so najbolj kompleksen sekretoren produkt evkariontskih celic. Najdemo jih predvsem pri ožigalkarjih, ki jih uporabljajo za pritrjanje in lovljenje. Ob mehanskem draženju se iz knidociste izproži stilet, ki v žrtev preko dolgega tubula vnese mešanico različnih toksinov. Zanima nas proteinska sestava knidociste, biosinteza in farmakološka aktivnost toksinov njej.
|
Anderluh G, Podlesek Z, Maček P (2000): A common motif in proparts of Cnidarian toxins and nematocyst collagens and its putative role. Biochim Biophys Acta 1476(2):372-376. |
|
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - |
|
Difuzijski in osmotski transport vode skozi eritrocitno membrano potekata po dveh poteh: a) skozi lipidni dvosloj in b) skozi vodne kanalčke-akvaporine. V sodelovanju s sodelavci iz Inštituta Jožef Stefan iz Ljubljane (Odsek za fiziko trdne snovi) proučujemo vpliv nepolarnih organskih snovi (napr. alkoholov) na vodno permeabilnost eritrocitne membrane. Publikacije: Lahajnar G, Maček P, Šmid P, Zupančič I (1995): Ethanol- and acetonitrile-induced inhibition of water diffusional permeability across bovine red blood cell membrane. Biochim Biophys Acta 1235(2):437-42. Lahajnar G, Maček P, Zupančič I (2000): Suppression of red cell diffusional water permeability by lipophilic solutes. Bioelectrochemistry 52: 179-185. |
|
